Recombinat DNA:- When foreign gene is inserted into a vector, then it is called as recombinant DNA.
पुनर्संयोजित DNA:- जब किसी वेक्टर में कोई बाहरी जीन डाला जाता है, तो उसे पुनर्संयोजित DNA कहा जाता है।
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Binary Vectors (बाइनरी वेक्टर्स):- These are plasmid systems used in plant genetic engineering that function with Agrobacterium tumefaciens to transfer a desired gene into plant cells. They are called binary because the system consists of two separate plasmids.
(ये पादप आनुवंशिक अभियांत्रिकी में प्रयुक्त प्लास्मिड प्रणालियाँ हैं जो वांछित जीन को पादप कोशिकाओं में स्थानांतरित करने के लिए एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियंस के साथ कार्य करती हैं। इन्हें बाइनरी इसलिए कहा जाता है क्योंकि इस प्रणाली में दो अलग-अलग प्लास्मिड होते हैं।)
> Originally, gene transfer used the large Ti (Tumor-inducing) plasmid of Agrobacterium tumefaciens. But Ti plasmid is very large and difficult to manipulate. So scientists divided it into two parts:
(मूल रूप से, जीन स्थानांतरण में एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियंस के विशाल Ti (ट्यूमर-प्रेरक) प्लास्मिड का उपयोग किया जाता था। लेकिन Ti प्लास्मिड बहुत बड़ा होता है और इसे नियंत्रित करना कठिन होता है। इसलिए वैज्ञानिकों ने इसे दो भागों में विभाजित किया:)
i. Disarmed Ti Plasmid (Helper Plasmid) [निष्क्रिय Ti प्लास्मिड (सहायक प्लास्मिड)]:-
> Contains vir genes (virulence genes)
[इसमें विषाणु जीन (विषाणुता जीन) होते हैं]
> vir genes help in transfer of T-DNA into plant cells
(विषाणु जीन पादप कोशिकाओं में T-DNA के स्थानांतरण में सहायता करते हैं)
> Does NOT contain tumor-causing genes
(इसमें ट्यूमर उत्पन्न करने वाले जीन नहीं होते हैं)
ii. Binary Vector (Small Plasmid) [बाइनरी वेक्टर (छोटा प्लास्मिड)]:- Contains: (इसमें शामिल हैं:)
> T-DNA region
(T-DNA क्षेत्र)
> Left Border (LB) & Right Border (RB) sequences
[बाएँ बॉर्डर (LB) और दाएँ बॉर्डर (RB) अनुक्रम]
> Gene of interest
(रुचि का जीन)
> Selectable marker gene (e.g., antibiotic resistance)
[चयन योग्य मार्कर जीन (उदाहरण: एंटीबायोटिक प्रतिरोध)]
> Origin of replication
(प्रतिकृति का उद्गम)
Examples (उदाहरण):- pBIN19, pCAMBIA, pGreen
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Chimeric DNA (काइमेरिक DNA):- It is a DNA molecule formed by joining DNA fragments from two different sources (organisms) into a single molecule. It is also called Recombinant DNA.
[यह एक ऐसा DNA अणु है जो दो अलग-अलग स्रोतों (जीवों) से प्राप्त DNA खंडों को जोड़कर एक अणु के रूप में बनता है। इसे पुनर्संयोजित DNA भी कहा जाता है।]
> The term comes from Chimera (a mythical organism made of parts from different animals). Similarly, chimeric DNA contains genetic material from different organisms.
[यह शब्द काइमेरा (विभिन्न जंतुओं के अंगों से बना एक पौराणिक जीव) से लिया गया है। इसी प्रकार, काइमेरिक DNA में विभिन्न जीवों से प्राप्त आनुवंशिक सामग्री होती है।]
Example (उदाहरण):- Human insulin gene inserted into a bacterial plasmid → Produces insulin in bacteria like Escherichia coli.
(मानव इंसुलिन जीन को जीवाणु प्लास्मिड में डाला गया → यह E. कोलाई जैसे जीवाणुओं में इंसुलिन का उत्पादन करता है।)
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Polylinkers (Multiple Cloning Sites – MCS) [पॉलीलिंकर (मल्टीपल क्लोनिंग साइट्स – MCS)]:-
Definition (परिभाषा):- A polylinker (also called Multiple Cloning Site – MCS) is a short synthetic DNA sequence present in cloning vectors that contains several unique restriction enzyme recognition sites. It allows easy insertion of a foreign gene into the vector.
[पॉलीलिंकर (जिसे मल्टीपल क्लोनिंग साइट – MCS भी कहा जाता है) क्लोनिंग वैक्टर में मौजूद एक छोटा सिंथेटिक DNA अनुक्रम होता है जिसमें कई विशिष्ट प्रतिबंध एंजाइम पहचान स्थल होते हैं। यह वेक्टर में किसी बाहरी जीन को आसानी से डालने की अनुमति देता है।]
Location (स्थान):- Polylinker is usually located within a selectable marker gene (e.g., lacZ gene in plasmids like pUC vectors) to help in screening recombinant clones.
[पॉलीलिंकर आमतौर पर चयन योग्य मार्कर जीन (जैसे, pUC वैक्टर जैसे प्लास्मिड में lacZ जीन) के भीतर स्थित होता है ताकि पुनर्संयोजित क्लोनों की स्क्रीनिंग में मदद मिल सके।]
Features (विशेषताएं):-
> Contains many restriction sites (EcoRI, BamHI, HindIII, etc.)
[इसमें कई प्रतिबंध स्थल होते हैं (EcoRI, BamHI, HindIII, आदि)]
> Each restriction site is unique (present only once in vector)
[प्रत्येक प्रतिबंध स्थल अद्वितीय होता है (वेक्टर में केवल एक बार मौजूद)]
> Small in size (20–100 base pairs)
[आकार में छोटा (20-100 बेस पेयर)]
> Facilitates directional cloning
(दिशात्मक क्लोनिंग को सुगम बनाता है)
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YAC (Yeast Artificial Chromosome):-> It was first described in 1983 by Murray and Szostak.
> These are artificially constructed vectors. The system can undergo replication and has the capability to insert foreign DNA sequences.
> Components such as the autonomously replication system (ARS), centromere and telomeres are taken from the yeast Saccharomyces cerevisiae for the construction of vectors.
YAC (यीस्ट आर्टिफिशियल क्रोमोसोम):-> इसका सर्वप्रथम वर्णन 1983 में मरे और स्ज़ोस्टैक द्वारा किया गया था।
> ये कृत्रिम रूप से निर्मित वेक्टर हैं। यह प्रणाली प्रतिकृति कर सकती है और इसमें बाहरी डीएनए अनुक्रमों को सम्मिलित करने की क्षमता है।
> सैकरोमाइसिस सेरेविसी नामक यीस्ट से स्वतः प्रतिकृति प्रणाली (एआरएस), सेंट्रोमियर और टेलोमियर जैसे घटक लेकर वैक्टर बनाए जाते हैं।
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PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) (पल्स्ड-फील्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस):- It is a modified gel electrophoresis technique used to separate very large DNA fragments (10 kb to several Mb) by applying an alternating electric field.
[यह एक संशोधित जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस तकनीक है जिसका उपयोग प्रत्यावर्ती विद्युत क्षेत्र लगाकर बहुत बड़े डीएनए खंडों (10 kb से कई mb तक) को अलग करने के लिए किया जाता है।]
Need of PFGE (PFGE की आवश्यकता):- Normal agarose gel electrophoresis cannot separate very large DNA fragments effectively. PFGE overcomes this limitation by changing the direction of the electric field periodically.
(सामान्य ऐगेरोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस बहुत बड़े DNA खंडों को प्रभावी ढंग से अलग नहीं कर सकता। PFGE विद्युत क्षेत्र की दिशा को समय-समय पर बदलकर इस सीमा को दूर करता है।)
Principle (सिद्धांत):-
> DNA molecules are embedded in agarose plugs.
(डीएनए अणु ऐगेरोज प्लग में समाहित होते हैं।)
> Electric field direction is switched at specific intervals.
(विद्युत क्षेत्र की दिशा को विशिष्ट अंतरालों पर बदला जाता है।)
> Large DNA fragments reorient slowly and move differently than smaller ones.
(बड़े DNA खंड धीरे-धीरे पुनर्व्यवस्थित होते हैं और छोटे खंडों से भिन्न गति करते हैं।)
> This allows separation based on size.
(इससे आकार के आधार पर पृथक्करण संभव होता है।)
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BAC (Bacterial Artificial Chromosome):-
> It was first developed by Shizuya in 1992.
> These are DNA constructs that are used for transformation and cloning in bacterial cells, mostly E.coli. Functional fertility plasmids or F-plasmids are used for the vector construction.
> The gene components included are rep6 for plasmid regulation, a selectable marker for antibiotic resistance, parA and parB for F-plasmid DNA, and T7 and Sp6 for transcription of inserted genes.
Features:-
- BAC vectors are DNA constructs that are used for cloning DNA in bacteria.
- These are simple plasmid which is designed to clone very large DNA fragments ranging in size from 75 to 300 kb.
- No chimerism seen.
- It is circular.
- Bacterial machinery does not have post-translational mechanism, hence the expression of eukaryotic proteins becomes difficult.
- 1-2 vectors are found per bacterial cell.
- More stable.
- Avantage:- The generation of BACs is quicker and more efficient, and also, it gives a better chromosome coverage map. Hence, today, BAC is preferred over YAC because they are more efficient.
- Applicable in modelling genetic diseases and human genome project.
BAC (बैक्टीरियल आर्टिफिशियल क्रोमोसोम):-
इसे सर्वप्रथम शिजुया ने 1992 में विकसित किया था।
ये डीएनए संरचनाएं हैं जिनका उपयोग जीवाणु कोशिकाओं, मुख्यतः ई. कोलाई में रूपांतरण और क्लोनिंग के लिए किया जाता है। कार्यात्मक उर्वरता प्लास्मिड या एफ-प्लास्मिड का उपयोग वेक्टर निर्माण के लिए किया जाता है।
इसमें शामिल जीन घटकों में प्लास्मिड विनियमन के लिए rep6, एंटीबायोटिक प्रतिरोध के लिए एक चयन योग्य मार्कर, F-प्लास्मिड डीएनए के लिए parA और parB, और सम्मिलित जीनों के प्रतिलेखन के लिए T7 और Sp6 शामिल हैं।
विशेषताएँ:-
- बीएसी वेक्टर डीएनए संरचनाएं हैं जिनका उपयोग बैक्टीरिया में डीएनए की क्लोनिंग के लिए किया जाता है।
- ये सरल प्लास्मिड हैं जिन्हें 75 से 300 केबी आकार के बहुत बड़े डीएनए खंडों को क्लोन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
- कोई काइमेरिज्म नहीं देखा गया।
- यह गोलाकार है।
- जीवाणु तंत्र में पोस्ट-ट्रांसलेशनल तंत्र नहीं होता है, इसलिए यूकेरियोटिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति मुश्किल हो जाती है।
प्रत्येक जीवाणु कोशिका में 1-2 वाहक पाए जाते हैं।
- और अधिक स्थिर।
लाभ :- बीएसी का निर्माण तेज़ और अधिक कुशल है, और साथ ही, यह बेहतर गुणसूत्र कवरेज मानचित्र प्रदान करता है। इसलिए, आज बीएसी को वाईएसी पर प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि वे अधिक कुशल हैं।
- आनुवंशिक रोगों के मॉडलिंग और मानव जीनोम परियोजना में लागू।
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Difference Between Plasmid Vector and Phage Vector (प्लास्मिड वेक्टर और फाज वेक्टर में अंतर):- Both plasmid vectors and phage vectors are used in recombinant DNA technology, but they differ in their utility and applications.
(पुनर्योजी DNA तकनीक में प्लास्मिड वेक्टर और फेज वेक्टर दोनों का उपयोग किया जाता है, लेकिन इनकी उपयोगिता और अनुप्रयोग भिन्न-भिन्न होते हैं।)
i. Nature of Vector (वेक्टर की प्रकृति):-
> Plasmid Vector → Small circular double-stranded DNA molecule. Example: pBR322, pUC19
(प्लास्मिड वेक्टर → छोटा वृत्ताकार द्वि-केन्द्रित DNA अणु। उदाहरण: pBR322, pUC19)
> Phage Vector → Derived from bacteriophages (viruses that infect bacteria), commonly from Bacteriophage lambda.
[फेज वेक्टर → बैक्टीरियोफेज (जीवाणुओं को संक्रमित करने वाले वायरस) से व्युत्पन्न, आमतौर पर बैक्टीरियोफेज लैम्डा से।]
ii. Insert Size Capacity (समाकलन क्षमता):-
Plasmid Vector (प्लास्मिड वेक्टर):-
> Can carry small DNA fragments (≈ 5–10 kb)
[छोटे DNA खंड (लगभग 5-10 kb) ले जा सकता है।]
> Suitable for cloning small genes
(छोटे जीनों की क्लोनिंग के लिए उपयुक्त।)
Phage Vector (फाज वेक्टर):-
> Can carry larger DNA fragments (≈ 15–25 kb in λ phage)
[बड़े DNA खंडों (λ फेज में लगभग 15-25 kb) को ले जा सकता है]
> Useful for genomic library construction
(जीनोमिक लाइब्रेरी निर्माण के लिए उपयोगी)
iii. Mode of Entry into Host (परपोषी में प्रवेश का तरीका):-
> Plasmid → Introduced by transformation
(प्लास्मिड → रूपांतरण द्वारा प्रवेश)
> Phage → Introduced by infection (more efficient DNA delivery)
[फाज → संक्रमण द्वारा प्रवेश (अधिक कुशल DNA वितरण)]
iv. Cloning Efficiency (क्लोनिंग दक्षता):-
> Plasmid → Lower efficiency compared to phage
(प्लास्मिड → फाज की तुलना में कम दक्षता)
> Phage → Higher efficiency due to viral infection mechanism
(फाज → वायरल संक्रमण तंत्र के कारण उच्च दक्षता)
v. Screening Method (स्क्रीनिंग विधि):-
> Plasmid → Antibiotic resistance markers
(प्लास्मिड → एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्कर)
> Phage → Plaque formation on bacterial lawn
(फाज → जीवाणु लॉन पर प्लाक निर्माण)
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Gene gun method:-
> It is a physical method of gene transfer.
> It is also called Biolistic method or Ballistic Method.
> In this, tungsten or gold particles of 1-2µm diameter are coated with DNA and fired them into the cell by a particle gun.
> Gold is expensive, but it is less harmful to cells.
> The cost of a particle gun is almost 15 lakhs.
> The particles are accelerated by compressed helium gas in the particle gun.
> DNA reaches inside the nucleus and becomes incorporated into the plant's genome.
> By this method, the gene is transferred to the meristem and embryo.
जीन गन विधि :-
> यह जीन स्थानांतरण की एक भौतिक विधि है।
> इसे बायोलिस्टिक विधि या बैलिस्टिक विधि भी कहा जाता है।
> इसमें , 1-2 माइक्रोमीटर व्यास वाले टंगस्टन या सोने के कणों को डीएनए से लेपित किया जाता है और एक पार्टिकल गन द्वारा उन्हें कोशिका में दागा जाता है ।
> सोना महंगा है, लेकिन यह कोशिकाओं के लिए कम हानिकारक है।
> पार्टिकल गन की कीमत लगभग 15 लाख रुपये है ।
> पार्टिकल गन में संपीड़ित हीलियम गैस द्वारा कणों को त्वरित किया जाता है ।
> डीएनए केंद्रक के अंदर पहुँच जाता है और पौधे के जीनोम में शामिल हो जाता है।
> इस विधि द्वारा जीन को मेरिस्टेम और भ्रूण में स्थानांतरित किया जाता है ।
Crown Gall Disease (क्राउन गॉल रोग):-
Causal Organism (रोगजनक):- Crown gall disease is caused by the bacterium Agrobacterium tumefaciens.
(क्राउन गॉल रोग एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियंस नामक जीवाणु के कारण होता है।)
Affected Plants (प्रभावित पौधे):- Rose, Grapevine, Apple, Peach, Many dicot ornamental and fruit crops.
(गुलाब, अंगूर, सेब, आड़ू, कई द्विबीजपत्री सजावटी और फलदार फसलें।)
Symptoms (लक्षण):-
> Tumor-like galls at crown region (junction of root & stem)
[जड़ और तने के जोड़ (क्राउन क्षेत्र) पर ट्यूमर जैसी गांठें बन जाती हैं।]
> Galls may also form on roots and stems
(जड़ों और तनों पर भी गांठें बन सकती हैं।)
> Young galls are soft and white
(नई गांठें मुलायम और सफेद होती हैं।)
> Older galls become hard, brown, and woody
(पुरानी गांठें सख्त, भूरी और लकड़ी जैसी हो जाती हैं।)
> Stunted growth and reduced yield
(विकास में रुकावट और उपज में कमी।)
Mode of Infection (संक्रमण का तरीका):-
> Bacteria enter through wounds (caused by pruning, insects, or cultivation).
[जीवाणु घावों (छंटाई, कीटों या खेती के कारण) के माध्यम से प्रवेश करते हैं।]
> The bacterium transfers a part of its Ti plasmid (T-DNA) into plant cells.
[जीवाणु अपने Ti प्लास्मिड (T-DNA) का एक हिस्सा पौधे की कोशिकाओं में स्थानांतरित कर देता है।]
> T-DNA integrates into plant genome → uncontrolled cell division → gall formation.
(T-DNA पौधे के जीनोम में एकीकृत हो जाता है → अनियंत्रित कोशिका विभाजन → गांठों का निर्माण।)
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Introduction:-
> The technology of recombinant DNA was developed in 1973 by Boyer and Cohen.
> It is popularly known as genetic engineering.
> Recombinat DNA:- When foreign gene is inserted into a vector, then it is called as recombinant DNA.
> Objective:- This is the natural mathod of amplification of gene of interest.
Process of Recombinant DNA Technology:- The complete process of recombinant DNA technology includes multiple steps-
Step-1. Isolation of Genetic Material:- The first and the initial step in Recombinant DNA technology is to isolate the desired DNA in its pure form i.e. free from other macromolecules.
Step-2.Cutting the gene at the recognition sites:- The restriction enzymes play a major role in determining the location at which the desired gene is inserted into the vector genome. These reactions are called ‘restriction enzyme digestions’.
Step-3. Ligation of DNA Molecules:- In this step of Ligation, the joining of the two pieces – a cut fragment of DNA and the vector together with the help of the enzyme DNA ligase.
Step-4. Insertion of Recombinant DNA Into Host:- In this step, the recombinant DNA is introduced into a recipient host cell. This process is termed as Transformation. Once the recombinant DNA is inserted into the host cell, it gets multiplied. As a result the inserted gene of interest is also multiplied.
Step-5. Amplifying the gene copies:- It is a process to amplify a single copy of DNA into thousands to millions of copies once the proper gene of interest has been cut using restriction enzymes.
Application of Recombinant DNA Technology:-
> DNA technology is also used to detect the presence of HIV in a person.
> Gene Therapy:- It is used as an attempt to correct the gene defects which give rise to heredity diseases.
> Clinical diagnosis:- ELISA is an example where the application of recombinant
>Recombinant DNA technology is widely used in Agriculture to produce genetically-modified plants such as Flavr Savr tomatoes, golden rice rich in proteins, and Bt-cotton to protect the plant against ball worms and a lot more.
> In the field of medicines, Recombinant DNA technology is used for the production of Insulin.
परिचय:-
रिकॉम्बिनेंट डीएनए की तकनीक का विकास 1973 में बोयर और कोहेन द्वारा किया गया था।
इसे आमतौर पर जेनेटिक इंजीनियरिंग के नाम से जाना जाता है।
> पुनर्संयोजित डीएनए:- जब किसी वेक्टर में कोई बाहरी जीन डाला जाता है, तो उसे पुनर्संयोजित डीएनए कहा जाता है।
उद्देश्य:- यह रुचि के जीन के प्रवर्धन की प्राकृतिक विधि है।
पुनर्संयोजित डीएनए प्रौद्योगिकी की प्रक्रिया:- पुनर्संयोजित डीएनए प्रौद्योगिकी की संपूर्ण प्रक्रिया में कई चरण शामिल हैं-
चरण-1. आनुवंशिक सामग्री का पृथक्करण:- पुनर्संयोजित डीएनए प्रौद्योगिकी में पहला और प्रारंभिक चरण वांछित डीएनए को उसके शुद्ध रूप में पृथक करना है, अर्थात् अन्य वृहद अणुओं से मुक्त।
चरण-2. जीन को पहचान स्थलों पर काटना:- वांछित जीन को वेक्टर जीनोम में किस स्थान पर डाला जाए, यह निर्धारित करने में प्रतिबंध एंजाइम महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इन प्रतिक्रियाओं को 'प्रतिबंध एंजाइम पाचन' कहा जाता है।
चरण-3. डीएनए अणुओं का लिगेशन:- लिगेशन के इस चरण में, डीएनए के कटे हुए खंड और वेक्टर को डीएनए लाइगेज एंजाइम की मदद से एक साथ जोड़ा जाता है।
चरण-4. मेजबान कोशिका में पुनर्योजी डीएनए का सम्मिलन:- इस चरण में, पुनर्योजी डीएनए को एक प्राप्तकर्ता मेजबान कोशिका में डाला जाता है। इस प्रक्रिया को रूपांतरण कहा जाता है। मेजबान कोशिका में पुनर्योजी डीएनए के प्रवेश करने के बाद, यह गुणन करने लगता है। परिणामस्वरूप, डाले गए लक्षित जीन का भी गुणन होता है।
चरण-5. जीन प्रतियों का प्रवर्धन:- यह एक ऐसी प्रक्रिया है जिसमें रुचि के उपयुक्त जीन को प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करके काटने के बाद डीएनए की एक प्रति को हजारों से लाखों प्रतियों में प्रवर्धित किया जाता है।
पुनर्संयोजित डीएनए प्रौद्योगिकी का अनुप्रयोग:-
डीएनए तकनीक का उपयोग किसी व्यक्ति में एचआईवी की उपस्थिति का पता लगाने के लिए भी किया जाता है।
जीन थेरेपी:- इसका उपयोग आनुवंशिक रोगों को जन्म देने वाले जीन दोषों को ठीक करने के प्रयास के रूप में किया जाता है।
नैदानिक निदान:- ELISA एक ऐसा उदाहरण है जहाँ पुनर्संयोजित यौगिकों का अनुप्रयोग होता है।
पुनर्संयोजित डीएनए प्रौद्योगिकी का उपयोग कृषि में आनुवंशिक रूप से संशोधित पौधों जैसे कि फ्लेवर सेवर टमाटर, प्रोटीन से भरपूर गोल्डन राइस और बॉल वर्म से पौधों की रक्षा करने के लिए बीटी-कपास आदि के उत्पादन के लिए व्यापक रूप से किया जाता है।
चिकित्सा क्षेत्र में, इंसुलिन के उत्पादन के लिए रिकॉम्बिनेंट डीएनए तकनीक का उपयोग किया जाता है।
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प्रोटोप्लास्ट पृथक्करण (Protoplast Isolation):- इसके 2 मुख्य चरण हैं –
(It has 2 main steps -)
a. पर्ण का निर्जमीकरण (Sterilization of Leaf)
b. एन्जाइम उपचार (Enzyme Treatment)
a. पर्ण का निर्जमीकरण (Sterilization of Leaf):- पर्ण को 1 मिनट के लिए 70% एथेनॉल में डुबोकर रखते हैं। इसके पश्चात इस पर्ण को 20 से 30 मिनट के लिए 2% NaOCl विलयन में डुबोकर रखते हैं। अब इस पर्ण को 3 मिनट तक आसुत जल से धो लेते हैं।
(Soak the leaf in 70% ethanol for 1 minute. After this, keep this leaf in 2% NaOCl solution for 20 to 30 minutes. Now wash this leaf with distilled water for 3 minutes.)
b. एन्जाइम उपचार (Enzyme Treatment):- अब इस निर्जमित पर्ण को क्रमश: 2 एंजाइमों पेक्टीनेज व सेलुलेज से उपचारित कराया जाता है। पेक्टीनेज एन्जाइम मध्य पटलिका को विघटित कर देता है। सेलुलेज एन्जाइम कोशिका भित्ति को विघटित कर देता है। इसके फलस्वरूप प्रोटोप्लास्ट प्राप्त होते हैं। परासरणी सान्द्रता को बढ़ाने के लिए 500 – 800 ml/L सोर्बिटोल या मैनीटोल मिला देते हैं।
(Now this sterilized leaf is treated with 2 enzymes, pectinase and cellulase, respectively. The pectinase enzyme disintegrates the middle lamella. Cellulase enzymes decompose the cell wall. As a result protoplasts are obtained. To increase osmotic concentration, add 500 - 800 ml / L of sorbitol or mannitol.)
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Introduction:-
> The technology of recombinant DNA was developed in 1973 by Boyer and Cohen.
> It is popularly known as genetic engineering.
> Recombinat DNA:- When foreign gene is inserted into a vector, then it is called as recombinant DNA.
> Objective:- This is the natural mathod of amplification of gene of interest.
Restriction Enzyme:- It is a nuclease enzyme that cleaves DNA sequence at a specific recognition sites known as restriction sites.
Discovery:- In 1970 the first restriction endonuclease enzyme HindII was isolated. For the subsequent discovery and characterization of numerous restriction endonucleases, in 1978 Daniel Nathans, Werner Arber, and Hamilton O. Smith awarded for Nobel Prize for Physiology or Medicine.
Restriction modification system:- In bacteria, modification enzymes methylate the bacterial DNA. Methylation of bacterial DNA at the recognition sequence typically protects the own DNA of the bacteria from being cleaved by restriction enzyme.
Types:- There are two different kinds of restriction enzymes:
(1) Exonucleases:- They catalyses hydrolysis of terminal nucleotides from the end of DNA or RNA molecule either 5’to 3’ direction or 3’ to 5’ direction. Example: exonuclease I, exonuclease II etc.
(2) Endonucleases:- They can recognize specific base sequence (restriction site) within DNA or RNA molecule and cleave internal phosphodiester bonds within a DNA molecule. Example: EcoRI, Hind III, BamHI etc.
Restriction Endonuclease (RE):-
Nomenclature:- Restriction endonucleases are named according to the organism in which they were discovered, using a system of letters and numbers.
For example, HindIII (pronounced “hindee-three”) was discovered in Haemophilus influenza (strain d). The Roman numerals are used to identify specific enzymes from bacteria that contain multiple restriction enzymes indicating the order in which restriction enzymes were discovered in a particular strain.
Classification of Restriction Endonucleases:- There are three major classes of restriction endonucleases based on the types of sequences recognized, the nature of the cut made in the DNA, and the enzyme structure -
a. Type I restriction enzymes
b. Type II restriction enzymes
c. Type III restriction enzymes
a. Type I restriction enzymes:-
> These enzymes have both restriction and modification activities. Restriction depends upon the methylation status of the target DNA.
> Cleavage occurs approximately 1000 bp away from the recognition site.
> The recognition site is asymmetrical and is composed of two specific portions in which one portion contain 3–4 nucleotides while another portion contain 4–5 nucleotides and both the parts are separated by a non-specific spacer of about 6–8 nucleotides.
> They require S-adenosylmethionine (SAM), ATP, and magnesium ions (Mg2+) for activity.
> These enzymes are composed of mainly three subunits, a specificity subunit that determines the DNA recognition site, a restriction subunit, and a modification subunit.
> Examples:- EcoB, EcoK
b. Type II restriction enzymes:-
> Restriction and modification are mediated by separate enzymes so it is possible to cleave DNA in the absence of modification. Although the two enzymes recognize the same target sequence, they can be purified separately from each other.
> Cleavage of nucleotide sequence occurs at the restriction site.
> These enzymes are used to recognize rotationally symmetrical sequence which is often referred as palindromic sequence.
> These palindromic binding site may either be interrupted (e.g. BstEII recognizes the sequence 5´-GGTNACC-3´, where N can be any nucleotide) or continuous (e.g. KpnI recognizes the sequence 5´-GGTACC-3´).
> They require only Mg2+ as a cofactor and ATP is not needed for their activity.
> Type II endonucleases are widely used for mapping and reconstructing DNA in vitro because they recognize specific sites and cleave just at these sites.
> Examples:- EcoR I, BamH I
c. Type III restriction enzymes:-
> These enzymes recognize and methylate the same DNA sequence but cleave 24–26 bp away.
> They have two different subunits, in which one subunit (M) is responsible for recognition and modification of DNA sequence and other subunit (R) has nuclease action.
> Mg+2 ions, ATP are needed for DNA cleavage and process of cleavage is stimulated by SAM.
> Cleave only one strand. Two recognition sites in opposite orientation are necessary to break the DNA duplex.
> Examples:- EcoP I, Hinf III
Applications:- In various applications related to genetic engineering DNA is cleaved by using these
restriction enzymes.
i. They are used in the process of insertion of genes into plasmid vectors during gene cloning and protein expression experiments.
ii. Restriction enzymes can also be used to distinguish gene alleles by specifically recognizing single base changes in DNA known as single nucleotide polymorphisms (SNPs). This is only possible if a mutation alters the restriction site present in the allele.
iii. Restriction enzymes are used for Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) analysis for identifying individuals or strains of a particular species.
DNA Ligase:- It is a specific type of enzyme that facilitates the joining of DNA strands together by catalyzing the formation of a phosphodiester bond. DNA ligase is used in DNA repair, DNA replication and genetic engineering.
Types:-
a. E. coli DNA ligase:-
> It is encoded by the lig gene. DNA ligase in E. coli, as well as most prokaryotes, uses energy gained by cleaving nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to create the phosphodiester bond.
> It does not ligate blunt-ended DNA and cannot join RNA to DNA efficiently.
> The activity of E. coli DNA ligase can be enhanced by DNA polymerase - I at the right concentrations.
b. T4 DNA ligase:-
> The DNA ligase from bacteriophage T4 (a bacteriophage that infects Escherichia coli bacteria).
> The T4 ligase is the most-commonly used in genetic engineering.
> It can ligate either cohesive or blunt ends of DNA, oligonucleotides, as well as RNA and RNA-DNA hybrids, but not single-stranded nucleic acids.
> It can also ligate blunt-ended DNA with much greater efficiency than E. coli DNA ligase.
> T4 DNA ligase cannot utilize NAD and it has an absolute requirement for ATP as a cofactor.
> The optimal incubation temperature for T4 DNA ligase is 16 °C.
c. Mammalian DNA ligase:- In mammals, there are four specific types of ligase -
i. DNA ligase I:- It ligates the nascent DNA of the lagging strand after the Ribonuclease H has removed the RNA primer from the Okazaki fragments.
ii. DNA ligase III:- Complexes with DNA repair protein XRCC1 to aid in sealing DNA during the process of nucleotide excision repair and recombinant fragments. Of the all known mammalian DNA ligases, only Lig III has been found to be present in mitochondria.
iii. DNA ligase IV:- Complexes with XRCC4. It catalyzes the final step in the non-homologous end joining DNA double-strand break repair pathway. It is also required for V(D)J recombination, the process that generates diversity in immunoglobulin and T-cell receptor loci during immune system development.
Note:- DNA ligase from eukaryotes and some microbes uses adenosine triphosphate (ATP) rather than NAD.
d. Thermostable DNA ligase:-
> Derived from a thermophilic bacterium, the enzyme is stable and active at much higher temperatures than conventional DNA ligases.
> Its half-life is 48 hours at 65 °C and greater than 1 hour at 95 °C.
> Ampligase DNA Ligase has been shown to be active for at least 500 thermal cycles (94 °C/80 °C) or 16 hours of cycling. This exceptional thermostability permits extremely high hybridization stringency and ligation specificity.
परिचय:-
रिकॉम्बिनेंट डीएनए की तकनीक का विकास 1973 में बोयर और कोहेन द्वारा किया गया था।
इसे आमतौर पर जेनेटिक इंजीनियरिंग के नाम से जाना जाता है।
> पुनर्संयोजित डीएनए:- जब किसी वेक्टर में कोई बाहरी जीन डाला जाता है, तो उसे पुनर्संयोजित डीएनए कहा जाता है।
उद्देश्य:- यह रुचि के जीन के प्रवर्धन की प्राकृतिक विधि है।
खोज:- 1970 में पहला रिस्ट्रिक्शन एंडोन्यूक्लिएज़ एंजाइम HindII पृथक किया गया। इसके बाद अनेक रिस्ट्रिक्शन एंडोन्यूक्लिएज़ की खोज और उनके लक्षण वर्णन के लिए, 1978 में डेनियल नैथंस, वर्नर आर्बर और हैमिल्टन ओ. स्मिथ को शरीर क्रिया विज्ञान या चिकित्सा के क्षेत्र में नोबेल पुरस्कार से सम्मानित किया गया।
प्रतिबंध संशोधन प्रणाली:- जीवाणुओं में, संशोधन एंजाइम जीवाणु डीएनए का मिथाइलेशन करते हैं। पहचान अनुक्रम पर जीवाणु डीएनए का मिथाइलेशन आमतौर पर जीवाणु के अपने डीएनए को प्रतिबंध एंजाइम द्वारा विखंडित होने से बचाता है।
प्रकार:- प्रतिबंध एंजाइम दो प्रकार के होते हैं:
(1) एक्सोन्यूक्लिएज़:- ये डीएनए या आरएनए अणु के अंतिम छोर पर स्थित टर्मिनल न्यूक्लियोटाइड के हाइड्रोलिसिस को उत्प्रेरित करते हैं, चाहे दिशा 5' से 3' की ओर हो या 3' से 5' की ओर। उदाहरण: एक्सोन्यूक्लिएज़ I, एक्सोन्यूक्लिएज़ II आदि।
(2) एंडोन्यूक्लिएज़:- ये डीएनए या आरएनए अणु के भीतर विशिष्ट बेस अनुक्रम (प्रतिबंध स्थल) को पहचान सकते हैं और डीएनए अणु के भीतर आंतरिक फॉस्फोडिएस्टर बंधों को तोड़ सकते हैं। उदाहरण: इकोआरआई, हिंड III, बैमएचआई आदि।
प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिएज़ (आरई):-
नामकरण:- प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिएस का नाम उस जीव के अनुसार रखा जाता है जिसमें उनकी खोज की गई थी, इसके लिए अक्षरों और संख्याओं की एक प्रणाली का उपयोग किया जाता है।
उदाहरण के लिए, HindIII (उच्चारण “हिंडी-थ्री”) की खोज हीमोफिलस इन्फ्लुएंजा (स्ट्रेन d) में हुई थी। रोमन अंकों का उपयोग उन बैक्टीरिया से विशिष्ट एंजाइमों की पहचान करने के लिए किया जाता है जिनमें कई प्रतिबंध एंजाइम होते हैं, जो एक विशेष स्ट्रेन में प्रतिबंध एंजाइमों की खोज के क्रम को दर्शाते हैं।
प्रतिबंध एंडोन्यूक्लियेस का वर्गीकरण:- मान्यता प्राप्त अनुक्रमों के प्रकार, डीएनए में किए गए कट की प्रकृति और एंजाइम संरचना के आधार पर प्रतिबंध एंडोन्यूक्लियेस के तीन प्रमुख वर्ग हैं।
ए. टाइप I प्रतिबंध एंजाइम
बी. टाइप II प्रतिबंध एंजाइम
सी. टाइप III प्रतिबंध एंजाइम
ए. टाइप I प्रतिबंध एंजाइम:-
इन एंजाइमों में प्रतिबंध और संशोधन दोनों प्रकार की गतिविधियाँ होती हैं। प्रतिबंध लक्ष्य डीएनए की मिथाइलेशन स्थिति पर निर्भर करता है।
> विखंडन पहचान स्थल से लगभग 1000 बीपी की दूरी पर होता है।
> पहचान स्थल असममित होता है और दो विशिष्ट भागों से बना होता है, जिसमें एक भाग में 3-4 न्यूक्लियोटाइड होते हैं जबकि दूसरे भाग में 4-5 न्यूक्लियोटाइड होते हैं और दोनों भाग लगभग 6-8 न्यूक्लियोटाइड के एक गैर-विशिष्ट स्पेसर द्वारा अलग किए जाते हैं।
> इनकी सक्रियता के लिए एस-एडेनोसिलमेथियोनिन (एसएएम), एटीपी और मैग्नीशियम आयनों (एमजी2+) की आवश्यकता होती है।
ये एंजाइम मुख्य रूप से तीन उपइकाइयों से बने होते हैं: एक विशिष्टता उपइकाई जो डीएनए पहचान स्थल को निर्धारित करती है, एक प्रतिबंध उपइकाई और एक संशोधन उपइकाई।
उदाहरण :- EcoB, EcoK
बी. टाइप II प्रतिबंध एंजाइम:-
प्रतिबंध और संशोधन अलग-अलग एंजाइमों द्वारा नियंत्रित होते हैं, इसलिए संशोधन के बिना भी डीएनए को विखंडित करना संभव है। हालांकि दोनों एंजाइम एक ही लक्ष्य अनुक्रम को पहचानते हैं, फिर भी उन्हें एक दूसरे से अलग-अलग शुद्ध किया जा सकता है।
> न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम का विखंडन प्रतिबंध स्थल पर होता है।
इन एंजाइमों का उपयोग घूर्णी रूप से सममित अनुक्रम को पहचानने के लिए किया जाता है, जिसे अक्सर पैलिंड्रोमिक अनुक्रम कहा जाता है।
ये पैलिंड्रोमिक बंधन स्थल या तो बाधित हो सकते हैं (उदाहरण के लिए BstEII अनुक्रम 5´-GGTNACC-3´ को पहचानता है, जहाँ N कोई भी न्यूक्लियोटाइड हो सकता है) या निरंतर (उदाहरण के लिए KpnI अनुक्रम 5´-GGTACC-3´ को पहचानता है)।
> उन्हें सहकारक के रूप में केवल Mg2+ की आवश्यकता होती है और उनकी गतिविधि के लिए ATP की आवश्यकता नहीं होती है।
टाइप II एंडोन्यूक्लियेस का उपयोग इन विट्रो में डीएनए की मैपिंग और पुनर्निर्माण के लिए व्यापक रूप से किया जाता है क्योंकि वे विशिष्ट स्थलों को पहचानते हैं और केवल इन्हीं स्थलों पर विखंडन करते हैं।
उदाहरण :- EcoR I, BamH I
सी. टाइप III प्रतिबंध एंजाइम:-
ये एंजाइम एक ही डीएनए अनुक्रम को पहचानते और मिथाइलेट करते हैं, लेकिन 24-26 बीपी दूर से काटते हैं।
इनमें दो अलग-अलग उपइकाइयाँ होती हैं, जिनमें से एक उपइकाई (एम) डीएनए अनुक्रम की पहचान और संशोधन के लिए जिम्मेदार होती है और दूसरी उपइकाई (आर) में नाभिकीय क्रिया होती है।
डीएनए के विखंडन के लिए Mg+2 आयनों और ATP की आवश्यकता होती है और विखंडन की प्रक्रिया SAM द्वारा उत्तेजित होती है।
केवल एक ही स्ट्रैंड को विभाजित करें। डीएनए डुप्लेक्स को तोड़ने के लिए विपरीत दिशा में स्थित दो पहचान स्थलों का होना आवश्यक है।
उदाहरण :- इकोपी I, हिन्फ III
अनुप्रयोग:- आनुवंशिक अभियांत्रिकी से संबंधित विभिन्न अनुप्रयोगों में डीएनए को इन उपकरणों का उपयोग करके विखंडित किया जाता है।
प्रतिबंधित एंजाइम।
i. जीन क्लोनिंग और प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रयोगों के दौरान प्लास्मिड वैक्टर में जीन डालने की प्रक्रिया में इनका उपयोग किया जाता है।
ii. जीन एलील्स को अलग करने के लिए रिस्ट्रिक्शन एंजाइमों का भी उपयोग किया जा सकता है, जो डीएनए में एकल न्यूक्लियोटाइड पॉलीमॉर्फिज्म (एसएनपी) के रूप में जाने जाने वाले एकल बेस परिवर्तनों को विशेष रूप से पहचानते हैं। यह तभी संभव है जब उत्परिवर्तन एलील में मौजूद रिस्ट्रिक्शन साइट को बदल दे।
iii. किसी विशेष प्रजाति के व्यक्तियों या उपभेदों की पहचान करने के लिए प्रतिबंध खंड लंबाई बहुरूपता (आरएफएलपी) विश्लेषण हेतु प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग किया जाता है।
डीएनए लाइगेज:- यह एक विशेष प्रकार का एंजाइम है जो फॉस्फोडिएस्टर बॉन्ड के निर्माण को उत्प्रेरित करके डीएनए स्ट्रैंड्स को आपस में जोड़ने में मदद करता है। डीएनए लाइगेज का उपयोग डीएनए की मरम्मत, डीएनए प्रतिकृति और आनुवंशिक इंजीनियरिंग में किया जाता है।
प्रकार:-
ए. ई. कोलाई डीएनए लाइगेज:-
यह lig जीन द्वारा एन्कोड किया जाता है। ई. कोलाई में डीएनए लाइगेज, साथ ही अधिकांश प्रोकैरियोट्स में, फॉस्फोडिएस्टर बॉन्ड बनाने के लिए निकोटिनमाइड एडेनिन डिन्यूक्लियोटाइड (एनएडी) को तोड़कर प्राप्त ऊर्जा का उपयोग करता है।
यह कुंद सिरे वाले डीएनए को जोड़ नहीं पाता है और आरएनए को डीएनए से कुशलतापूर्वक नहीं जोड़ सकता है।
ई. कोलाई डीएनए लाइगेज की गतिविधि को डीएनए पॉलीमरेज़-I द्वारा उचित सांद्रता पर बढ़ाया जा सकता है।
बी. टी4 डीएनए लाइगेज:-
बैक्टीरियोफेज टी4 (एक बैक्टीरियोफेज जो एस्चेरिचिया कोलाई बैक्टीरिया को संक्रमित करता है) से प्राप्त डीएनए लाइगेज।
> आनुवंशिक अभियांत्रिकी में टी4 लाइगेज का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है।
यह डीएनए के संसंजक या कुंद सिरों, ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स, साथ ही आरएनए और आरएनए-डीएनए संकरों को जोड़ सकता है, लेकिन एकल-स्ट्रैंडेड न्यूक्लिक एसिड को नहीं।
यह ई. कोलाई डीएनए लाइगेज की तुलना में कहीं अधिक दक्षता के साथ कुंद सिरे वाले डीएनए को भी जोड़ सकता है।
> टी4 डीएनए लाइगेज एनएडी का उपयोग नहीं कर सकता है और इसे सहकारक के रूप में एटीपी की पूर्ण आवश्यकता होती है।
टी4 डीएनए लाइगेज के लिए इष्टतम ऊष्मायन तापमान 16 डिग्री सेल्सियस है।
सी. स्तनधारी डीएनए लाइगेज:- स्तनधारियों में चार विशिष्ट प्रकार के लाइगेज पाए जाते हैं -
i. डीएनए लाइगेज I:- यह राइबोन्यूक्लेज H द्वारा ओकाज़ाकी खंडों से आरएनए प्राइमर को हटाने के बाद लैगिंग स्ट्रैंड के नवजात डीएनए को जोड़ता है।
ii. डीएनए लाइगेज III:- यह डीएनए मरम्मत प्रोटीन XRCC1 के साथ मिलकर न्यूक्लियोटाइड एक्सिशन रिपेयर और रिकॉम्बिनेंट फ्रेग्मेंट्स की प्रक्रिया के दौरान डीएनए को सील करने में सहायता करता है। सभी ज्ञात स्तनधारी डीएनए लाइगेज में से केवल लाइगेज III ही माइटोकॉन्ड्रिया में पाया गया है।
iii. डीएनए लाइगेज IV:- XRCC4 के साथ कॉम्प्लेक्स बनाता है। यह डीएनए के दोहरे स्ट्रैंड के टूटने की मरम्मत के लिए गैर-समरूप छोरों को जोड़ने की प्रक्रिया के अंतिम चरण को उत्प्रेरित करता है। यह V(D)J पुनर्संयोजन के लिए भी आवश्यक है, जो प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास के दौरान इम्युनोग्लोबुलिन और टी-सेल रिसेप्टर लोकी में विविधता उत्पन्न करने वाली प्रक्रिया है।
नोट:- यूकेरियोट्स और कुछ सूक्ष्मजीवों में पाए जाने वाले डीएनए लाइगेज, एनएडी के बजाय एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) का उपयोग करते हैं।
d. ऊष्मास्थिर डीएनए लाइगेज:-
ऊष्मा-प्रेमी जीवाणु से प्राप्त यह एंजाइम, पारंपरिक डीएनए लाइगेस की तुलना में कहीं अधिक तापमान पर स्थिर और सक्रिय होता है।
65 डिग्री सेल्सियस पर इसकी अर्धायु 48 घंटे है और 95 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे से अधिक है।
> एम्प्लीगेज डीएनए लाइगेज कम से कम 500 तापीय चक्रों (94 °C/80 °C) या 16 घंटे के चक्रण के लिए सक्रिय पाया गया है। यह असाधारण तापस्थिरता अत्यंत उच्च संकरण कठोरता और लाइगेशन विशिष्टता की अनुमति देती है।
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Indirect Gene Transfer:- When stable transformation is achieved by incorporating genes into the genome of plant cells with the help of a biological factor, it is called indirect gene transfer. Agrobacterium bacterium is used in this.
Agrobacterium mediated Gene Transfer:-
• Agrobacterium is a gram -ve bacterium found in soil around plant roots.
• Two species of Agrobacterium bacteria cause diseases in dicot plants:-
i. Agrobacterium tumefaciens
ii. Agrobacterium rhizogenes
i. Agrobacterium tumefaciens:- It causes Crown gall disease in angiosperm plants. Ti-plasmid is found in it.
ii. Agrobacterium rhizogenes:- It cause hairy root disease in angiosperm plants. Ri - plasmid is found in it.
• Recombinant DNA is made by incorporating the desired gene into the T - DNA portion of the Ti plasmid. Which are transferred to Agrobacterium cell.
• Now cut round pieces of sterilized leaf.
• Now incubate these pieces with Agrobacterium overnight.
• Now kept these pieces in Shooting medium for 2 days.
• Now add Kanamycin and Carbenicillin in this shooting medium and cultured for 3-4 weeks.
• Now transfer this to the rooting medium, add Kanamycin and Carbenicilin, culture it for 3-4 weeks.
• Now establish this plant in a pot in green house.
• After a few days, establish the plant in the soil of the field.
Mechanism of Gene Transfer:-
• The T - DNA portion of the Ti - plasmid has the property that it can integrate into the plant's genome.
• Leaf pieces release the Aceto - Syringine chemical that activates the Vir - Operon of T - DNA.
• Once activated, the T-DNA portion separates from the plasmid and enters into many plant cells.
• Now this T-DNA integrates into the genome by going into the nucleus.
• This results in stable transformation of the plant.
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पौधों में जीन स्थानांतरण, कृषि जीवाणु द्वारा जीन स्थानांतरण। क्राउन गॉल रोग, ट्यूमर उत्पन्न करने वाला सिद्धांत और टीआई प्लास्मिड, पादप कोशिकाओं में टी-डीएनए का समावेश।
एग्रोबैक्टीरियम द्वारा मध्यस्थता से जीन स्थानांतरण:-
• एग्रोबैक्टीरियम एक ग्राम-ऋणात्मक जीवाणु है जो पौधों की जड़ों के आसपास की मिट्टी में पाया जाता है।
• एग्रोबैक्टीरियम बैक्टीरिया की दो प्रजातियाँ द्विबीजपत्री पौधों में रोग उत्पन्न करती हैं:-
i. एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियंस
ii. एग्रोबैक्टीरियम राइजोजेन्स
i. एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियंस :- यह एंजियोस्पर्म पौधों में क्राउन गॉल रोग का कारण बनता है। इसमें टीआई-प्लास्मिड पाया जाता है।
ii. एग्रोबैक्टीरियम राइजोजेन्स :- यह एंजियोस्पर्म पौधों में रोएंदार जड़ रोग का कारण बनता है। इसमें Ri-प्लाज्मिड पाया जाता है।
• वांछित जीन को Ti प्लास्मिड के T-DNA भाग में शामिल करके पुनर्संयोजित DNA बनाया जाता है। इन्हें एग्रोबैक्टीरियम कोशिका में स्थानांतरित किया जाता है।
• अब रोगाणुरहित पत्तों के गोल टुकड़े काट लें।
• अब इन टुकड़ों को एग्रोबैक्टीरियम के साथ रात भर इनक्यूबेट करें।
• अब इन टुकड़ों को दो दिनों के लिए शूटिंग मीडियम में रखा गया।
• अब इस शूटिंग मीडियम में कैनामाइसिन और कार्बेनिकिलिन मिलाएं और 3-4 सप्ताह तक कल्चर करें।
• अब इसे रूटिंग मीडियम में स्थानांतरित करें, इसमें कैनामाइसिन और कार्बेनिसिलिन मिलाएं और इसे 3-4 सप्ताह तक कल्चर करें।
• अब इस पौधे को ग्रीनहाउस में एक गमले में लगा दें।
• कुछ दिनों बाद, पौधे को खेत की मिट्टी में लगा दें।
जीन स्थानांतरण की प्रक्रिया:-
• टीआई-प्लास्मिड के टी-डीएनए भाग में यह गुण होता है कि यह पौधे के जीनोम में एकीकृत हो सकता है।
• पत्ती के टुकड़े एसिटो-सिरिंगिन नामक रसायन छोड़ते हैं जो टी-डीएनए के विर-ऑपेरॉन को सक्रिय करता है।
• सक्रिय होने के बाद, टी-डीएनए भाग प्लास्मिड से अलग हो जाता है और कई पादप कोशिकाओं में प्रवेश कर जाता है।
• अब यह टी-डीएनए केंद्रक में जाकर जीनोम में एकीकृत हो जाता है।
• इसके परिणामस्वरूप पौधे का स्थिर रूपांतरण होता है।
Electroporation:- Introduction of DNA into plant cells by making minute pores in the plant cell membrane is called as electroporation.
> This method involves suspension of plant protoplasts in a suitable ionic solution containing linearized
recombinant plasmid DNA.
> This mixture is then exposed to low voltage-long pulses or high voltage short pulses for the desired number of cycles.
> The electrical pulses are thought to induce transient pores in the plasma lemma through which the DNA molecules are incorporated.
> Treated protoplasts are then cultured to obtain cell colonies and plants.
इलेक्ट्रोपोरेशन:- पादप कोशिका झिल्ली में सूक्ष्म छिद्र बनाकर पादप कोशिकाओं में डीएनए का प्रवेश कराना इलेक्ट्रोपोरेशनकहलाता है
> इस विधि में पादप प्रोटोप्लास्ट को रेखीयकृत पुनर्संयोजित प्लास्मिड डीएनए युक्त उपयुक्त आयनिक विलयन में निलंबित करना शामिल है।
> इसके बाद इस मिश्रण को वांछित संख्या में चक्रों के लिए कम वोल्टेज वाले लंबे पल्स या उच्च वोल्टेज वाले छोटे पल्स के संपर्क में लाया जाता है।
> ऐसा माना जाता है कि विद्युत स्पंदन प्लाज्मा लेम्मा में क्षणिक छिद्र उत्पन्न करते हैं, जिनके माध्यम से डीएनए अणु समाहित हो जाते हैं।
> उपचारित प्रोटोप्लास्ट को फिर संवर्धित करके कोशिका कॉलोनियां और पौधे प्राप्त किए जाते हैं।
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