2021 Solved Old Paper (BOT

पुनर्विभेदन (Redifferentiation):- कैलस की कुछ कोशिकाएं अंग आध्यकों में विभेदित हो जाती हैं जो विभज्योतक कोशिकाओं को उत्पन्न करते हैं जिनसे पादप के अंगों का निर्माण होता है। इस प्रकार कैलस की अविभेदित कोशिकाओं के विभेदन से पादप अंगों का निर्माण होता है। इसे पुनर्विभेदन कहते हैं।

(Some cells of the callus differentiate into organ primordia that produce meristematic cells from which plant organs are formed. Thus differentiation of the undifferentiated cells of the callus creates plant organs. This is called redifferentiation.)

Caulogenesis:- जब कैलस ऊतक से केवल अपस्थानिक प्ररोह कलिका का निर्माण होता है तो इसे Caulogenesis कहते हैं।

(When only the adventitious shoot is formed from the callus tissue, it is called Caulogenesis.)

B5 Medium (Gamborg’s Medium) [बी5 माध्यम (गैम्बर्ग माध्यम)]:-

> Developed by Gamborg (1968) mainly for cell suspension and callus culture, especially in legumes.

[गैम्बर्ग (1968) द्वारा मुख्य रूप से कोशिका निलंबन और कैलस संवर्धन के लिए विकसित किया गया, विशेष रूप से दलहनों में।]

> Contains moderate salts and high vitamins (thiamine, nicotinic acid, pyridoxine).

[इसमें मध्यम लवण और उच्च मात्रा में विटामिन (थायमिन, निकोटिनिक अम्ल, पाइरिडोक्सिन) होते हैं।]

> Widely used for rapid cell division and protoplast/callus culture.

(तीव्र कोशिका विभाजन और प्रोटोप्लास्ट/कैलस संवर्धन के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।)

N6 Medium (Chu’s Medium) [N6 माध्यम (चू माध्यम)]:-

> Developed by Chu (1975) for anther and pollen culture of cereals.

[चू (1975) द्वारा अनाजों के परागकोष और पराग संवर्धन के लिए विकसित किया गया।]

> Contains high nitrate and ammonium nitrogen, ideal for monocots.

(इसमें उच्च मात्रा में नाइट्रेट और अमोनियम नाइट्रोजन होता है, जो एकबीजपत्री पौधों के लिए आदर्श है।)

> Used for haploid production and tissue culture of rice, wheat and maize.

(चावल, गेहूं और मक्का के अगुणित उत्पादन और ऊतक संवर्धन के लिए उपयोग किया जाता है।)

अंगजनन (Organogenesis):-

1. सामान्य परिचय (General Introduction):-

· परिभाषा (Definition):- ऊतक संवर्धन में कर्तोतक की कोशिकाओं से अपस्थानिक मूल, तने, पर्ण, पुष्प कलिका आदि के निर्माण की प्रक्रिया को अंगजनन कहते हैं।

(In tissue culture, the process of the formation of the adventitious root, stem, leaf, flower bud etc. from the cells of explant is called organogenesis.)

· अपस्थानिक (Adventitious):- जब पादप अंग का निर्माण कर्तोतक के ऐसे असामान्य उत्पत्ति बिन्दु से होता है जहाँ पहले से बना हुआ विभज्योतक अनुपस्थित होता है तो इसे अपस्थानिक अंग निर्माण कहते हैं।

(When the plant organ is produced from such an unusual point of origin in the explant where the pre-existing meristem is absent, it is called adventitious organ formation.)

2. अंगजनन के प्रकार (Types of Organogenesis):-

संवर्धन माध्यम में हार्मोन्स के संयोजन के आधार पर अंगजनन 2 प्रकार का होता है। इनके लिए Rule of Thumb का उपयोग किया जाता है।

(Organogenesis is of 2 types depending on the combination of hormones in the culture medium. Rule of Thumb is used for this purpose.)

a. प्रत्यक्ष अंगजनन (Direct Organogenesis)

b. अप्रत्यक्ष अगजनन (Indirect Organogenesis)

a. प्रत्यक्ष अंगजनन (Direct Organogenesis):-

जब Auxin व Cytokinin की मात्रा में बहुत अधिक अन्तर रखा जाता है तो कर्तोतक से सीधे प्ररोह या मूल का निर्माण होता है। इसे प्रत्यक्ष अंगजनन कहते हैं।

(When there is a huge difference in the amount of Auxin and Cytokinin, the shoot or root is directly formed from the explant. This is called direct organogenesis.)

अनेक पौधों में कैलस के उप संवर्धन से अवांछित कायिक क्लोनीय विविधताएँ विकसित हो जाती हैं। इससे बचने के लिए प्रत्यक्ष अंगजनन किया जाता है।

(In many plants, undesirable soma-clonal variations develop by sub-culturing the callus. To avoid this, direct organogenesis is done.)

b. अप्रत्यक्ष अगजनन (Indirect Organogenesis):-

जब Auxin व Cytokinin की मात्रा को लगभग समान रखा जाता है तो कर्तोतक से कैलस का निर्माण होता है। कैलस से फिर अंग निर्माण को प्रेरित किया जाता है। इसे अप्रत्यक्ष अंगजनन कहते हैं।

(When the amount of Auxin and Cytokinin is kept almost the same, callus is formed from the explant. Callus is then induced for organ formation. This is called indirect organogenesis.)

3. अंगजनन को प्रभावित करने वाले कारक (Factors Affecting Organogenesis):-

a. भौतिक कारक (Physical Factors)

b. रासायनिक कारक (Chemical Factors)

a. भौतिक कारक (Physical Factors):-

i. प्रकाश की गुणवत्ता (Quality of Light):-

नीला प्रकाश प्ररोह निर्माण को प्रेरित करता है जबकि लाल प्रकाश मूल निर्माण को प्रेरित करता है।

(Blue light induces shoot formation while red light induces root construction.)

ii. तापमान (Temperature):- 33°C तक तापमान में वृद्धि करने पर तंबाकू में कैलस की वृद्धि बढ़ जाती है। परन्तु प्ररोह कलिका विभेदन के लिए कम तापमान 18°C उपयुक्त होता है।

(Increasing the temperature up to 33 °C increases the callus growth in tobacco. But low temperature 18 ° C is suitable for shoot bud differentiation.)

b. रासायनिक कारक (Chemical Factors):-

i. पादप हार्मोन्स (Plant Hormones):- Cytokinin प्ररोह कलिका निर्माण को प्रेरित करता है। Auxin मूल निर्माण को प्रेरित करता है। Cytokinin में Adenine की तुलना में Kinetin 30,000 गुना अधिक प्रभावी होता है।

(Cytokinin induces shoot bud formation. Auxin induces the root formation. Kinetin is 30,000 times more effective than adenine in cytokinins.)

ii. औक्सिन अवरोधक (Auxin Inhibitors):-

माध्यम में उपस्थित होने पर ये Auxin के प्रभाव को रोक देते हैं अर्थात प्ररोह निर्माण को प्रेरित करता है।

(When present in the medium, they inhibit the effect of Auxin, it means induces shoot formation.)

उदाहरण (Examples):-

Ø फॉस्फेट (Phosphate)

Ø कैसीन हाइड्रोलाइसेट (Casein Hydrolysate)

Ø टायरोसिन (Tyrosine)

Ø ऐडेनिन (Adenine)

Ø फिनोलिक यौगिक (Phenolic Compounds)

Ø कीलेटिंग कारक (Chelating agents)

Ø ऐब्सिसिक अम्ल (Abscisic Acid)

पादप ऊतक संवर्धन का इतिहास (History of Plant Tissue Culture):-

· Haberlandt (1902):- "कायिक कोशिकाओं से भ्रूण का विकास संभव है। ’’ यह विचार इनके द्वारा 1902 में दिया गया था। इन्होंने Lamium purpureum की परिपक्व पर्ण की कोशिकाओं और Tradescantia व Pulmonaria की रोम कोशिकाओं को 1 - 5% सुक्रोज युक्त नौप के विलयन में संवर्धित करने का प्रयास किया परन्तु सफलता नहीं मिली।

(‘’It is possible to grow embryos from somatic cells.’’ This idea was visualized by him in 1902. He tried to grow the mature leaf cells of Lamium purpureum and hair cells of Tradescantia and Pulmonaria in knop’s solution containing 1 – 5% sucrose without success.)

· Robbins and Kotte (1922):- इन्होने स्वतंत्र रूप से सीमित अवधि के लिए मक्का और मटर के मूल शिखाग्र को संवर्धित करने में सफलता प्राप्त की थी।

(They independently were able to grow the root tips of maize and pea for a limited period.)

· White (1922):- इन्होंने अकार्बनिक लवण, खमीर निष्कर्ष और सुक्रोज युक्त द्रव माध्यम में टमाटर (Lycopersicum esculentum) के मूल शिखाग्र को सतत रूप से लम्बी अवधि तक संवर्धित करने में सफलता प्राप्त की थी।

[He successfully grew the root tips of tomato (Lycopersicum esculentum) continuously for a prolonged period in liquid medium containing inorganic salts, yeast extract and sucrose.]

· Kogl (1934):- इन्होंने बताया कि Went (1926) द्वारा खोजा गया वृद्धि पदार्थ IAA (इंडोल एसिटिक एसिड) था।

[He reported that the growth substance invented by Went (1926) was IAA (Indole Acetic Acid).]

· Snow (1935):- इन्होंने एधा सक्रियता को उत्तेजित करने के लिए IAA की क्षमता का प्रदर्शन किया।

(He demonstrated the ability of IAA to stimulate cambial activity.)

· White, Nobecourt and Goutheret (1939):- इन्होंने साथ साथ और स्वतंत्र रूप से टमाटर, Salix capraea व Populus nigra के कैलस संवर्धनों को लम्बी अवधि के लिए स्थापित करने में सफलता प्राप्त की।

(They simultaneously and independently reported establishment of tomato, Salix capraea and Populus nigra callus cultures for prolonged period.)

· Nobecourt (1939):- इन्होंने गाजर के कैलस संवर्धनों में मूल विभेदन को देखा।

(He reported the differentiation of roots in callus cultures of carrot.)

· White (1939):- इन्होंने तम्बाकू के प्ररोह संवर्धनों में सफलतापूर्वक पर्णीय प्ररोह कलिकायों को प्रेरित किया।

(He successfully induced leafy shoot buds in tobacco stem cultures.)

· Since 1939 it was possible to culture:-

i. भ्रूण (Van Overbeck - 1941)

[Embryos (Van Overbeck - 1941)]

ii. एकल पृथक्कृत कोशिका (Muir - 1954)

[Single isolated cell (Muir - 1954)]

iii. निलम्बन संवर्धनों को स्थापित करना (Steward and Shantz - 1955)

[To establish suspension cultures (Steward and Shantz - 1955)]

· Dawson (1942):- इन्होंने पादप ऊत्तक संवर्धन की कृत्रिम रूप से महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट्स के जैवसंश्लेषण करने की जन्मजात क्षमता को प्रदर्शित किया जो जैविक महत्व के अनेक द्वितीयक मेटाबोलाइट्स का उत्पादन करता है।

(He demonstrated the innate capacity of plant tissue cultures to biosynthesize important metabolites in vitro which led to the production of many secondary metabolites of vital importance.)

· Miller and Skoog (1955):-

Ø मिलर ने kinetin की खोज की।

(Miller discovered the kinetin.)

Ø Miller व Skoog ने तम्बाकू ऊतक संवर्धनों का उपयोग करके अंग निर्माण के हार्मोन द्वारा नियंत्रण की अवधारणा का प्रदर्शन किया।

(Miller and Skoog demonstrated the concept of hormonal control of organ formation using tobacco tissue cultures.)

· Steward (1958):- इन्होंने एक कायिक कोशिका की अंतर्निहित क्षमता, जो सम्पूर्ण पौधे में विकसित करती है, को प्रकट किया, जो कोशिकाओं की पूर्णशक्तता को साबित करती है।

(He revealed the inherent capacity of a somatic cell to regenerate into complete plant which proved the totipotency of cells.)

· Steward and Rienert (1958):- इन्होंने गाजर के संवर्धनों में कायिक भ्रूणजनन को देखा।

(They reported somatic embryogenesis in carrot cultures.)

· Morel (1960):- इन्होंने विभाज्योत्तक संवर्धन के द्वारा रोगजनक मुक्त ऑर्किड पौधों का उत्पादन किया और इस पद्धति का बाद में अनेक पौधों की जातियों में उपयोग किया गया।

(He produced pathogen free orchid plants through meristem culture and this method was later exploited in many plant species.)

· Guha and Maheshwari (1964):- इन्होंने Datura inoxa के परागकण या परागकोष संवर्धन से अगुणित भ्रूण और उसके बाद पौध निर्माण को प्रेरित किया।

(He induced haploid embryos and subsequently plantlets from pollen or anther cultures of Datura inoxa.)

· Cocking (1960):- इन्होंने टमाटर (Lycopersicum esculentum) के मूल शिखाग्रों से प्रोटोप्लास्ट के एंजाइमेटिक पृथक्करण को प्रदर्शित किया।

[He reported enzymatic isolation of protoplasts from root tips of tomato (Lycopersicum esculentum).]

· Power (1970):- इन्होंने प्रोटोप्लास्ट संलयन का विचार दिया।

(He gave the idea of protoplast fusion.)

· Takebe (1971):- इन्होंने तम्बाकू की पर्णमध्योत्तक कोशिकाओं से पृथक किए गए प्रोटोप्लास्ट से पौधों के निर्माण में सफलता प्राप्त की।

(He reported successful regeneration of plantlets from protoplasts isolated from tobacco mesophyll cells.)

· 1971 के बाद से अंतराजातीय व अंतरावंशीय संकरों के उत्पादन ली अनेक रिपोर्ट उपलब्ध हैं। (Bhojwani and Rajdan - 1983)

[Since 1971 many reports are available on the production of interspecific and intergeneric hyrids.(Bhojwani and Rajdan - 1983)]

· Heinz and Mee (1969, 1971):- कायिकक्लोनीय विविधों के उनके अवलोकन ने कई शोधकर्ताओं को इस दिशा में काम करने के लिए प्रोत्साहित किया और उन्हें वांछित लक्षणों युक्त किस्में जारी करने की अनुमति दी।

(Their observation of somaclonal variants encouraged many researchers to work in this direction and allowed them to release many varieties with desired characters.)

· Redenbaugh (1984):- उन्होंने कृत्रिम बीजों के उत्पादन की दृष्टि से कायिक भ्रूणों का कैप्सूलीकरण किया।

(He reported the encapsulation of somatic embryos with a view to produce artificial seeds.)

· Kitto and Janick (1985) and Ow (1986):- इन्होंने सफलतापूर्वक आनुवंशिक रूपान्तरण का प्रदर्शन किया और fire fly luciferas जीन के द्वारा रूपान्तरण से पराजैनिक तंबाकू के पौधे प्राप्त किए।

(They successfully demonstrated the genetic transformation and obtained transgenic tobacco plants by transformation of fire fly luciferase gene.)

परागकण संवर्धन (Pollen Culture):-

1. परिचय (Introduction):-

· परिभाषा (Definition):-

परागकण या लघुबीजाणु संवर्धन एक कृत्रिम प्रक्रिया है जिसमें निर्जमित परिस्थितियों में परागकण या लघुबीजाणु को इसकी एककेन्द्रकी अवस्था पर साबुत परागकोष से निकाला जाता है और पोषक माध्यम पर संवर्धित किया जाता है।

(Pollen grain or microspore culture is an artificial process in which pollens or microspores are extracted from the intact anther at its uni-nucleated state and cultured on the nutrient medium under sterilized conditions.)

· एंड्रोजेनेसिस (Androgenesis):- पूर्णशक्त परागकण से कोशिका विभाजन व विभेदन की श्रंखला द्वारा अगुणित पौधों के कृत्रिम रूप से विकसित होने की प्रक्रिया को एंड्रोजेनेसिस कहते हैं। यह 2 प्रकार का होता है –

(The process of artificial development of haploid plants by a series of cell division and differentiation from a totipotent pollen is called androgenesis. It is of two types -)

i. प्रत्यक्ष एंड्रोजेनेसिस (Direct Androgenesis):-

लघुबीजाणु जाइगोट के समान व्यवहार करता है तथा कुछ परिवर्तनों द्वारा भ्रूण समान संरचना का निर्माण करता है जो आगे अगुणित पौधे में विकसित हो जाता है। इसे भ्रूणजनन कहते हैं।

(The microspore behaves like a zygote and by some changes the it forms a embryo like structure which further develops into haploid plants. This is called embryogenesis.)

ii. अप्रत्यक्ष एंड्रोजेनेसिस (Indirect Androgenesis):-

लघुबीजाणु बार बार विभाजित होकर कैलस ऊतक का निर्माण करता है। इसमें विभेदन होने से अगुणित पौधा बन जाता है। इसे अंगजनन कहते हैं।

(The microspore divides repeatedly to form the callus tissue. Differentiation leads to development of haploid plant. This is called organogenesis.)

2. सिद्धान्त (Principle):-

· लघुबीजाणु की पूर्णशक्तता के उपयोग से अगुणित पौधे का निर्माण किया जाता है।

(The haploid plant is developed using the totipotency of the microspore.)

· लघुबीजाणु में गुणसूत्रों का केवल एक समुचय उपस्थित होता है।

(Only one set of chromosomes is present in the microspore.)

· अगुणित पादप निर्माण की प्रक्रिया में लघुबीजाणु का नर युग्मक निर्माण का सामान्य विकास व कार्य रुक जाता है। कायिक कोशिका विभाजन के लिए इसे बलपूर्वक नए उपापचय पथ की ओर मोड़ दिया जाता है।

(In the process of haploid plant development, the normal development and function of the microspore of the male gametes formation stops. It is forced into a new metabolic pathway for somatic cell division.)

· परागकोष संवर्धन में परागकोष की द्विगुणित कायिक कोशिकाएं भी कभी कभी संवर्धन परिस्थितियों में सक्रिय हो जाती हैं और संवर्धित होकर अनचाहे द्विगुणित कैलस या प्लांटलेट्स का निर्माण करती हैं। कभी कभी काइमेरा बन जाता है। ऐसा कैलस या प्लांटलेट जिसकी कुछ कोशिकाएं अगुणित व कुछ कोशिकाएं द्विगुणित होती हैं, काइमेरा कहलाता है। इस समस्या से बचने परागकोषों से निकाले गए स्वतंत्र परागकणों को पोषक माध्यम पर संवर्धित किया जाता है।

(In pollen culture, diploid somatic cells of the anther also sometimes become active under culturing conditions and grow to form unwanted diploid callus or plantlets. Sometimes the chimera is formed. A callus or plantlet whose some cells are haploid and some cells are diploid, is called chimera. To avoid this problem, free pollens extracted from the anthers are cultured on the nutrient medium.)

3. विधि (Procedure):-

· पुष्पन पर तंबाकू की बन्द पुष्पीय कलिकाओं को एकत्रित करते हैं। 17 – 22 mm लंबाई की पुष्पीय कालिका का चयन करते हैं जब बाह्यदलों की लंबाई दलों की लंबाई के बराबर होती है। खुल रही सभी पुष्पीय कलिकाओं को त्याग देते हैं।

(Collect the closed floral buds of the tobacco upon flowering. A floral bud of length 17 - 22 mm is selected when the length of the sepals is equal to the length of the petals. Discards all opening floral buds.)

· चयनित पुष्पीय कलिकाओं को LAF कैबिनेट के अन्दर ले जाते हैं। प्रत्येक पुष्पीय कालिका में 5 परागकोष होते हैं और बन्द कलिकाओं के अन्दर इनकी सतह स्वत: निर्जमित होती है। पुष्पीय कलिकाओं के सतही निर्जमीकरण के लिए इन्हें पहले 10 सेकंड के लिए 70% ऐथेनोल में डुबोकर रखते हैं और फिर 10 मिनट के लिए 20% सोडियम हाइपोक्लोराइट विलयन में डुबोकर रखते हैं। अतिरिक्त रसायन को सतह से हटाने के लिए पुष्पीय कलिकाओं को निर्जमित आसुत जल से 3 बार धोते हैं। अंत में इन पुष्प कलिकाओं को निर्जमित पेट्रीडिश में स्थानांतरित कर देते हैं।

(Selected floral buds are carried inside the LAF cabinet. Each floral bud contain 5 anther and its surface is self sterilized within the closed buds. For surface sterilization of the floral buds, first dip them in 70% ethanol for 10 seconds and then in 20% sodium hypochlorite solution for 10 minutes. To remove excess chemicals from the surface, the floral buds are washed 3 times with sterilized distilled water. Finally these floral buds are transferred to the sterilized patridish.)

· अब एक तीखे चाकू के द्वारा कालिका के एक तरफ कट लगाते हैं और चिमटी की सहायता से दलों व बाह्यदलों को हटा देते हैं। अब एक अन्य चिमटी की सहायता से 5 पुंकेसरों को पुतन्तु सहित उखाड़कर एक अन्य निर्जमित पेट्रीडिश में स्थानांतरित करते हैं। अब 5 पुंकेसरों के पुतन्तुओं को चाकू या ब्लेड से काटकर अलग कर देते हैं जिससे केवल परागकोष रह जाते हैं। क्षतिग्रस्त परागकोषों को भी त्याग देते हैं।

(Now with a sharp knife, cut one side of the bud and remove the sepals and petals with the help of forceps. Now uproot 5 stamens along with filaments with the help of another forceps and transfer them to another sterilized patridish. Now cut the filaments of 5 stamens with a knife or blade, leaving only the anthers. Discard damaged anthers.)

· लगभग 50 परागकोषों को 20ml द्रव माध्यम युक्त एक छोटे निर्जमित बीकर में डालते हैं। द्रव माध्यम के रूप में MS या White या Nitsch का माध्यम ले सकते हैं।

(Almost 50 anthers are placed in a small sterilized beaker containing 20ml of liquid medium. MS or White or Nitsch medium can be used as the liquid medium.)

· अब एक निर्जमित ग्लास रोड की सहायता से परागकोषों को बीकर की आंतरिक दीवार के साथ दबाते हैं जिससे परागकण बाहर द्रव माध्यम में आ जाते हैं।

(Now the anthers are pressed along the inner wall of the beaker with the help of a sterilized glass road, bringing the pollen out into the liquid medium.)

· अब इन एकरूप परागकोषों को नायलोन की छलनी से छानते हैं जिससे परागकोष ऊतक के टुकड़े पृथक हो जाते हैं। शेष बचे छनित को अब परागकण निलंबन कहते हैं।

(Now these squeezed anthers are filtered with a nylon sieve, which separates the pieces of anthers. The remaining filtrate is now called pollen suspension.)

· अब इस परागकण निलंबन को 5 मिनट के लिए कम स्पीड (500 – 800 RPM) पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। अधिप्लवी में परागकोषों छोटे टुकड़े उपस्थित होते हैं इसलिए इसे त्याग देते हैं। परागकणों की पैलेट को ताजा द्रव माध्यम में निलंबित करते हैं।

(Now this pollen suspension is centrifuged at low speed (500 - 800 RPM) for 5 minutes. Small pieces of anthers are present in the supernatant, so discard it. The palette of pollens is suspended in fresh liquid medium.)

· सेंट्रीफ्यूगेशन व ताजा द्रव माध्यम में पुन: निलम्बन को दोहराकर 2 बार परागकणों को धो लेते हैं।

(After repeated centrifugation and suspended fresh liquid medium, pollens are washed twice.)

· अब एक 5cm पेट्रीडिश में द्रव माध्यम लेते हैं। पिपेट के उपयोग से 2.5ml परागकण निलम्बन लेकर ठोस द्रव माध्यम पर 5cm पेट्रीडिश में फैला देते हैं। परागकण द्रव माध्यम में बहुत अच्छी वृद्धि करते हैं, परन्तु यदि आवश्यक हो तो इन्हें प्लेटिंग के द्वारा बहुत कोमल अगार युक्त माध्यम पर भी उगाया जा सकता है। 1 ml परागकण निलम्बन में 10³ से 10⁴ तक परागकण होते हैं।

(Now take liquid medium in a 5cm patridish. Using a pipette, take 2.5ml pollen suspension and spread it on 5cm patridish on liquid medium. Pollens grow very well in the liquid medium, but they can also be grown on a very soft agar medium by plating, if necessary. 1 ml pollen suspension contain 10³ to 10⁴pollens.)

· अब इन पेट्रीडिशों को इंक्यूबेटर में रखकर 27 – 30°C ताप पर ऊष्मायन किया जाता है। 16 घण्टे का प्रकाश व 8 घण्टे का अंधेरा दिया जाता है। प्रकाश की तीव्रता कम (500 लक्स) रखी जाती है।

[Now these petridishes are kept in incubator and incubate at 27 - 30 ° C temperature. 16 hours of light and 8 hours of darkness is given. Light intensity is kept low (500 lux).]

· 30 दिन के पश्चात तरुण भ्रूण समान संरचनाएं देखी जा सकती हैं।

(After 30 days young embryo like structures can be seen.)

· अब इन अगुणित भ्रूणो को नये ताजा अगार माध्यम पर संवर्धन ट्यूब में स्थापित करते हैं। इस अवस्था पर संवर्धनों का 24 – 28°C ताप पर ऊष्मायन किया जाता है। 14 घंटे का प्रकाश व 10 घंटे का अंधकार दिया जाता है। प्रकाश की तीव्रता 2000 लक्स रखी जाती है।

(Now these haploid embryos are placed in a culture tube on new fresh agar medium. At this stage the cultures are incubated at 24 - 28 ° C temperature. 14 hours of light and 10 hours of darkness are given. Light intensity is maintained at 2000 lux.)

· जब अगुणित प्लांटलेट्स की लंबाई 50 mm हो जाती है तो अगार माध्यम से स्वतंत्र करने के लिए नल के बहते हुए पानी में धोया जाता है। अब तुरन्त इन्हें औटोक्लेवित कम्पोस्ट युक्त छोटे गमलों में रोपित कर दिया जाता है। शुष्कन को रोकने के लिए प्रत्येक पौधे को काँच के बीकर से ढक देते हैं और आगे के परिवर्धन के लिए नम ग्रीन हाउस में रख देते हैं। कुछ सप्ताहों पश्चात काँच के बीकरों को हटा देते हैं और पौधों को मृदा युक्त बड़े गमलों में रोपित कर देते हैं जहाँ ये पौधे परिपक्व होकर अंत में पुष्पन करते हैं।

(When the length of haploid plantlets is 50 mm, they are washed in running water to free it from the agar medium. Now they are immediately planted in small pots with autoclaved compost. To prevent drying, cover each plant with a glass beaker and place it in a moist greenhouse for further growth. After a few weeks, the glass beakers are removed and the plants are planted in large pots containing soil where these plants mature and eventually flowering.)

Commercial Feasibility:-

1. Market Scenario:-

> Demand for tissue cultured plantlets is growing rapidly. India, with its low cost skilled labour as well as scientific manpower (both of which are essential for tissue culture) has a natural advantage. Additional favourable factors are the wide range of plant biodiversity in the country and favorable tropical climate (which enables greenhouses with low energy consumption).

> The potential for the domestic market is enormous and by conservative estimates it is around Rs. 200 crores with an annual growth rate of 20%. There are more than 70 established commercial tissue culture units. Their production capacity ranges between 0.5 million to 10 million plants per annum with an aggregate production capacity of about 200 million plantlets per year.

> The protocols have either been developed in-house or transferred through the various research institutions and universities engaged in development of the protocols through support of the Department of Biotechnology (DBT) Currently, the focus of the companies is mainly banana, floriculture,

sugarcane and potato.

> With increasing awareness about the advantages of tissue culture raised plants in improving yield and quality, their domestic consumption is also increasing optimistically. The major consumers of tissue culture raised plants are the State Agriculture Department, Agri Export Zones (AEZs), State agencies such as Spice Board, sugar industry and private farmers. The paper industry, medicinal plant industry and State Forest Departments are using tissue culture raised plants in a limited scale. Also a number of progressive farmers and nurseries in the states are the major consumers of Tissue culture plants particularly for flowers, banana, sugarcane and medicinal plants.

2. Establishment of Commercial Plant Tissue Culture Unit:- Commercial plant tissue culture unit consists of the following components:

a. Storage room for chemicals:- It is advisable to have a separate area for storage of chemicals, apparatus and equipments. Chemicals required in small amounts should not be purchased in large quantities as they may lose their activity, pick up moisture or get contaminated. Such problems can be

overcome by purchasing small lots on a regular basis.

b. Washing and Media Preparation Room:-

> The glassware washing area should be located near the sterilization room. This area should have at least one large sink but two sinks are preferable with running tap water. Adequate workspace is required on each sides of the sink; this space is used for glassware soaking and drainage. Plastic netting can be placed on surfaces near the sink to reduce glassware breakage and enhance water drainage. The outlet

pipe from the sink should be of PVC to resist damage from acids and alkalis. Both hot and cold water should be available and the water still and de-ionisation unit should be located nearby. The washing room should be swapped periodically. Mobile drying racks can be used and lined with cheesecloth to prevent water dripping and loss of small objects.

> Ovens or hot air-cabinets should be located close to the glassware washing and storage area. Dust-proof cabinets and storage containers should be installed to allow for easy access to glassware. When culture vessels are removed from the growth area, they are often autoclaved to kill contaminants and to soften semi-solid media. It should be possible to move the vessels easily to the washing area. The glassware storage area should be close to the wash area to expedite storage and access for media preparation.

> The media preparation room should have smooth walls and floors, which enable easy cleaning to maintain a high degree of cleanliness.

> Minimum number of doors and windows should be provided in this room but within the local fire safety regulations. Media preparation area should be equipped with both tap and purified water. An appropriate system for water purification must be selected and fitted after careful consideration of the cost and quality. A number of electrical appliances are required for media preparation; hence, it is essential to have safety devices like fire extinguisher, fire blanket and a first aid kit in the media preparation room. A variety of glassware, plastic ware and stainless steel apparatus is required for measuring, mixing, and media storage. These should be stored in the cabinets built under the worktables and taken out for use as and when required.

> The water source and glassware storage area should be in or near the media preparation area. The workbench tops should be made with plastic laminate surfaces that can tolerate frequent cleaning. Media storage room should have capacity to storage the media for at least 7 days. Sterility Class

1,00,000 is desirable for media storage room.

c. Inoculation Room:-

> The most important work area is the Inoculation room where the core activity takes place. The transfer area needs to be as clean as possible with minimal air disturbance. Walls and floors of the Inoculation room must be smooth to ensure frequent cleaning. The doors and windows should be minimal to prevent contamination, but within local safety code. There is no special lighting requirement in the transfer room. The illumination of the laminar airflow chamber is sufficient for work.

> Sterilization of the instruments can be done with glass-bead sterilizers or flaming after dipping in alcohol, usually ethanol. The culture containers should be stacked on mobile carts (trolleys) to facilitate easy movement from the medium storage room to the transfer room, and finally to the culture room. Fire extinguishers and first aid kits should be provided in the transfer room as a safety measure. Special laboratory shoes and coats should be worn in this area. Ultraviolet (UV) lights are sometimes installed in transfer areas to disinfect the room; these lights should be used only when people and plant material are not in the room. Sterility Class 1,00,000 is desirable for inoculation room which can be achieved through installation of pressurized air module or air handling unit.

d. Growth Room:-

> Culture room is an equally important area where plant cultures are maintained under controlled environmental conditions to achieve optimal growth. It is advisable to have more than one growth room to provide varied culture conditions since different plant species may have different requirements of light and temperature during in vitro culture.

> Also, in the event of the failure of cooling or lighting in one room, the plant cultures can be moved to another room to prevent loss of cultures. In the growth room, the number of doors should be minimal to prevent contamination. The culture containers can be placed on either fixed or mobile shelves. Mobile shelves have the advantage of providing access to cultures from both sides of the shelves. The height of the shelves should not exceed 2m.

> The primary source of illumination in the growth room is normally from the lights mounted on the shelves. Overhead light sources can be minimized, as they would be in use only while working during the dark cycle. Plant cultures may not receive uniform light from the conventional downward illumination. Lights directly fitted to the racks create uneven heat distribution. Sideways illumination is an alternative, which requires less number of lights, and provides more uniform lighting. But care has to be taken not to break the lights while moving the cultures across the shelves. Sterility Class 1,00,000 is desirable for growth room.

व्यावसायिक व्यवहार्यता:-

1. बाजार परिदृश्य:-

ऊतक संवर्धन द्वारा तैयार पौधों की मांग तेजी से बढ़ रही है। भारत में कुशल श्रम और वैज्ञानिक क्षमता (जो ऊतक संवर्धन के लिए आवश्यक हैं) की कम लागत के कारण स्वाभाविक लाभ है। इसके अतिरिक्त, देश में पौधों की व्यापक जैव विविधता और अनुकूल उष्णकटिबंधीय जलवायु (जो कम ऊर्जा खपत वाले ग्रीनहाउस को संभव बनाती है) भी सहायक कारक हैं।

घरेलू बाजार में अपार संभावनाएं हैं और अनुमानतः यह लगभग 200 करोड़ रुपये का है, जिसकी वार्षिक वृद्धि दर 20% है। यहां 70 से अधिक स्थापित वाणिज्यिक ऊतक संवर्धन इकाइयां हैं। इनकी उत्पादन क्षमता प्रति वर्ष 0.5 मिलियन से 10 मिलियन पौधों के बीच है, और कुल उत्पादन क्षमता लगभग 200 मिलियन पौधे प्रति वर्ष है।

प्रोटोकॉल या तो कंपनी के भीतर ही विकसित किए गए हैं या जैव प्रौद्योगिकी विभाग (डीबीटी) के सहयोग से प्रोटोकॉल विकास में लगे विभिन्न अनुसंधान संस्थानों और विश्वविद्यालयों के माध्यम से स्थानांतरित किए गए हैं। वर्तमान में, कंपनियों का मुख्य ध्यान केले और पुष्पकृषि पर है।

गन्ना और आलू।

टिशू कल्चर से उगाए गए पौधों की पैदावार और गुणवत्ता में सुधार के फायदों के बारे में बढ़ती जागरूकता के साथ, घरेलू स्तर पर भी इनकी खपत में आशाजनक वृद्धि हो रही है। टिशू कल्चर से उगाए गए पौधों के प्रमुख उपभोक्ता राज्य कृषि विभाग, कृषि निर्यात क्षेत्र (एईजेड), मसाला बोर्ड जैसी राज्य एजेंसियां, चीनी उद्योग और निजी किसान हैं। कागज उद्योग, औषधीय पौध उद्योग और राज्य वन विभाग सीमित मात्रा में टिशू कल्चर से उगाए गए पौधों का उपयोग कर रहे हैं। इसके अलावा, राज्यों में कई प्रगतिशील किसान और नर्सरियां टिशू कल्चर से उगाए गए पौधों, विशेष रूप से फूलों, केले, गन्ने और औषधीय पौधों के प्रमुख उपभोक्ता हैं।

2. वाणिज्यिक पादप ऊतक संवर्धन इकाई की स्थापना:- वाणिज्यिक पादप ऊतक संवर्धन इकाई में निम्नलिखित घटक शामिल हैं:

क. रसायनों का भंडारण कक्ष:- रसायनों, उपकरणों और साज-सामान के भंडारण के लिए एक अलग स्थान होना उचित है। कम मात्रा में आवश्यक रसायनों को अधिक मात्रा में नहीं खरीदना चाहिए क्योंकि इससे उनकी सक्रियता कम हो सकती है, उनमें नमी आ सकती है या वे दूषित हो सकते हैं। इस प्रकार की समस्याओं से बचा जा सकता है।

नियमित रूप से छोटी-छोटी मात्रा में सामान खरीदकर इस समस्या पर काबू पाया जा सकता है।

ख. धुलाई और मीडिया तैयारी कक्ष:-

कांच के बर्तनों को धोने का स्थान नसबंदी कक्ष के पास होना चाहिए। इस क्षेत्र में कम से कम एक बड़ा सिंक होना चाहिए, लेकिन नल के पानी की सुविधा वाले दो सिंक बेहतर रहेंगे। सिंक के दोनों ओर पर्याप्त कार्यक्षेत्र होना आवश्यक है; इस स्थान का उपयोग कांच के बर्तनों को भिगोने और पानी निकालने के लिए किया जाता है। कांच के बर्तनों के टूटने को कम करने और पानी की निकासी को बेहतर बनाने के लिए सिंक के पास की सतहों पर प्लास्टिक की जाली लगाई जा सकती है।

सिंक से निकलने वाला पाइप पीवीसी का होना चाहिए ताकि अम्ल और क्षार से होने वाले नुकसान से सुरक्षित रहे। गर्म और ठंडा पानी उपलब्ध होना चाहिए और पानी को स्थिर करने और डी-आयोनाइज़ेशन यूनिट पास में ही स्थित होनी चाहिए। कपड़े धोने का कमरा समय-समय पर बदला जाना चाहिए। पानी टपकने और छोटी वस्तुओं के खोने से बचाने के लिए पोर्टेबल सुखाने वाले रैक का उपयोग किया जा सकता है और उन्हें मलमल के कपड़े से ढका जा सकता है।

कांच के बर्तनों को धोने और रखने के क्षेत्र के पास ही ओवन या गर्म हवा वाले कैबिनेट होने चाहिए। कांच के बर्तनों तक आसानी से पहुँचने के लिए धूल-रोधी कैबिनेट और भंडारण कंटेनर लगाए जाने चाहिए। जब संवर्धन पात्रों को वृद्धि क्षेत्र से हटाया जाता है, तो संदूषकों को नष्ट करने और अर्ध-ठोस माध्यम को नरम करने के लिए उन्हें अक्सर ऑटोक्लेव किया जाता है। पात्रों को धोने के क्षेत्र में आसानी से ले जाने की सुविधा होनी चाहिए। माध्यम तैयार करने के लिए भंडारण और पहुँच को आसान बनाने के लिए कांच के बर्तनों का भंडारण क्षेत्र धोने के क्षेत्र के पास होना चाहिए।

मीडिया तैयार करने वाले कमरे की दीवारें और फर्श चिकने होने चाहिए, जिससे उच्च स्तर की स्वच्छता बनाए रखने के लिए सफाई करना आसान हो।

इस कमरे में न्यूनतम संख्या में दरवाजे और खिड़कियां होनी चाहिए, लेकिन स्थानीय अग्नि सुरक्षा नियमों का पालन करते हुए। मीडिया तैयार करने वाले क्षेत्र में नल और शुद्ध पानी दोनों की व्यवस्था होनी चाहिए। जल शोधन प्रणाली का चयन और स्थापना लागत और गुणवत्ता को ध्यान में रखते हुए सावधानीपूर्वक की जानी चाहिए। मीडिया तैयार करने के लिए कई विद्युत उपकरणों की आवश्यकता होती है; इसलिए, मीडिया तैयार करने वाले कमरे में अग्निशामक यंत्र, फायर ब्लैंकेट और प्राथमिक चिकित्सा किट जैसे सुरक्षा उपकरण होना आवश्यक है। मापने, मिलाने और मीडिया भंडारण के लिए विभिन्न प्रकार के कांच के बर्तन, प्लास्टिक के बर्तन और स्टेनलेस स्टील के उपकरण आवश्यक हैं। इन्हें वर्कटेबल के नीचे बने कैबिनेट में रखा जाना चाहिए और आवश्यकतानुसार निकाला जाना चाहिए।

> जल स्रोत और कांच के बर्तनों का भंडारण क्षेत्र मीडिया तैयार करने वाले क्षेत्र में या उसके पास होना चाहिए। वर्कबेंच के ऊपरी भाग प्लास्टिक लैमिनेट सतहों से बने होने चाहिए जो बार-बार सफाई सहन कर सकें। मीडिया भंडारण कक्ष में कम से कम 7 दिनों तक मीडिया को संग्रहित करने की क्षमता होनी चाहिए। रोगाणुहीनता वर्ग

मीडिया स्टोरेज रूम के लिए 1,00,000 की क्षमता वांछनीय है।

सी. टीकाकरण कक्ष:-

सबसे महत्वपूर्ण कार्यक्षेत्र टीकाकरण कक्ष है, जहाँ मुख्य कार्य संपन्न होता है। स्थानांतरण क्षेत्र यथासंभव स्वच्छ होना चाहिए और वायु का प्रवाह न्यूनतम होना चाहिए। टीकाकरण कक्ष की दीवारें और फर्श चिकने होने चाहिए ताकि बार-बार सफाई की जा सके। संक्रमण से बचाव के लिए दरवाजे और खिड़कियाँ न्यूनतम होनी चाहिए, लेकिन स्थानीय सुरक्षा नियमों के अनुरूप होनी चाहिए। स्थानांतरण कक्ष में प्रकाश व्यवस्था की कोई विशेष आवश्यकता नहीं है। लैमिनर एयरफ्लो कक्ष की रोशनी कार्य के लिए पर्याप्त है।

उपकरणों को कांच के मनकों वाले स्टेरिलाइज़र से या अल्कोहल, आमतौर पर इथेनॉल में डुबोकर आग से कीटाणुरहित किया जा सकता है। कल्चर कंटेनरों को मोबाइल कार्ट (ट्रॉली) पर रखा जाना चाहिए ताकि मीडियम स्टोरेज रूम से ट्रांसफर रूम और अंत में कल्चर रूम तक आसानी से ले जाया जा सके। सुरक्षा उपाय के तौर पर ट्रांसफर रूम में अग्निशामक यंत्र और प्राथमिक चिकित्सा किट उपलब्ध कराई जानी चाहिए। इस क्षेत्र में विशेष प्रयोगशाला जूते और कोट पहनना अनिवार्य है। कभी-कभी कमरे को कीटाणुरहित करने के लिए ट्रांसफर क्षेत्रों में पराबैंगनी (यूवी) लाइटें लगाई जाती हैं; इन लाइटों का उपयोग केवल तभी किया जाना चाहिए जब कमरे में लोग और पौधे की सामग्री मौजूद न हो। इनोक्यूलेशन रूम के लिए स्टेरिलिटी क्लास 1,00,000 वांछनीय है, जिसे प्रेशराइज्ड एयर मॉड्यूल या एयर हैंडलिंग यूनिट लगाकर प्राप्त किया जा सकता है।

डी. ग्रोथ रूम:-

संवर्धन कक्ष एक समान रूप से महत्वपूर्ण क्षेत्र है जहाँ इष्टतम वृद्धि प्राप्त करने के लिए नियंत्रित पर्यावरणीय परिस्थितियों में पादप संवर्धन किया जाता है। विभिन्न संवर्धन परिस्थितियाँ प्रदान करने के लिए एक से अधिक संवर्धन कक्ष रखना उचित है, क्योंकि विभिन्न पादप प्रजातियों की इन विट्रो संवर्धन के दौरान प्रकाश और तापमान की आवश्यकताएँ भिन्न हो सकती हैं।

इसके अलावा, यदि किसी कमरे में शीतलन या प्रकाश व्यवस्था विफल हो जाती है, तो पौधों को दूसरे कमरे में स्थानांतरित किया जा सकता है ताकि उनका नुकसान न हो। वृद्धि कक्ष में संदूषण से बचाव के लिए दरवाजों की संख्या न्यूनतम होनी चाहिए। संवर्धन कंटेनरों को स्थिर या चल अलमारियों पर रखा जा सकता है। चल अलमारियों का लाभ यह है कि अलमारियों के दोनों ओर से संवर्धन तक पहुंच प्रदान की जा सकती है। अलमारियों की ऊंचाई 2 मीटर से अधिक नहीं होनी चाहिए।

वृद्धि कक्ष में प्रकाश का प्राथमिक स्रोत सामान्यतः अलमारियों पर लगे बल्ब होते हैं। ऊपर से आने वाले बल्बों की संख्या कम से कम रखी जा सकती है, क्योंकि इनका उपयोग केवल अंधेरे चक्र के दौरान ही किया जाएगा। पारंपरिक नीचे की ओर से आने वाली रोशनी से पौधों को एकसमान प्रकाश नहीं मिल पाता है। रैक पर सीधे लगे बल्बों से ऊष्मा का वितरण असमान होता है। पार्श्व रोशनी एक वैकल्पिक व्यवस्था है, जिसमें कम बल्बों की आवश्यकता होती है और अधिक एकसमान प्रकाश मिलता है। लेकिन पौधों को अलमारियों पर इधर-उधर ले जाते समय बल्बों को टूटने से बचाना आवश्यक है। वृद्धि कक्ष के लिए 1,00,000 की रोगाणुहीनता श्रेणी वांछनीय है।

Plant tissue culture: A historical perspective (पादप ऊतक संवर्धन: एक ऐतिहासिक परिप्रेक्ष्य)