2020 Solved Old Paper (BOT - 303D) New OK

विविभेदन (Dedifferentiation):-

·   परिभाषा (Definition):- इस प्रक्रिया में परिपक्व व विभेदित कोशिकाएं अपनी पहचान को खो देती हैं तथा आद्य या प्रारम्भिक कोशिकाएं बन जाती हैं और इनमें विभाजन की क्षमता विकसित हो जाती है।

(In this process, mature and differentiated cells lose their identity and become primordial or initial cells and develop the ability to divide.)

·   यह कोशिकाओं की विकासात्मक क्षमता को बढ़ाता है।

(It increases the developmental efficiency of cells.)

·   यह विभेदन का प्रत्यावर्तन (विपरीत प्रक्रिया) होता है इसलिए एक ही कोशिका वंशावली में हो सकता है।

(It is the reversion of differentiation so can occur in the same cell lineage.)

·  यह उन सभी प्रक्रियाओं के लिए उपयोग किया जा सकता है जो कोशिकीय क्षमता को बढ़ाती हैं।

(It can be used for all processes that increase cellular efficiency.)

·   सभी बहुकोशिकीय जीवों में जीनों की संख्या निश्चित होती है। परन्तु इनकी कोशिकाएं सभी जीनों को अभिव्यक्त नहीं करती हैं। बल्कि जीनों के एक भाग को ही अभिव्यक्त करती हैं। ऐसी कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से विभेदित कहते हैं।

(All multicellular organisms have a fixed number of genes. But their cells do not express all genes. Rather they expresses only a part of genes. Such cells are called genetically differentiated.)

·  आनुवंशिक रूप से पूर्णतया विभेदित कोशिका जीनोम में कोड किए सभी जीनों को अभिव्यक्त करेगी। ऐसी कोशिका का वास्तव में अस्तित्व नहीं होता है।

(A genetically fully differentiated cell will express all genes coded in the genome. Such a cell does not really exist.)

·  जाइगोट में 2 गुण होते हैं –

(Zygote has 2 properties -)

i. उच्च विकासात्मक क्षमता

(High developmental potential)

ii. अच्छी तरह से परिभाषित जीन अभिव्यक्ति पैटर्न

(Well defined gene expression pattern)

अत: जाइगोट को सबसे कम विभेदित या विविभेदित माना जाता है।

(Hence the zygote is considered to be the least differentiated or dedifferentiated.)

·  उसी प्रकार (Similarly):-

Ø  Stem cells कम विभेदित या विविभेदित होती हैं।

(Stem cells are less differentiated or dedifferentiated.)

Ø  कायिक कोशिकाएं अधिक विभेदित होती हैं।

(The somatic cells are more differentiated.)

Ø  इस प्रकार stem cells कायिक कोशिकाओं की तुलना में कम विभेदित होती हैं।

(Thus stem cells are less differentiated than somatic cells.)

·  उच्च विकासात्मक क्षमता होने के बावजूद भी Stem cells विभेदित भी होती हैं।

(Stem cells are differentiate too despite having a high developmental capacity.)

·  पादप की प्ररोह व मूल की विभज्योत्तक कोशिकाएं पूर्णशक्त होती हैं।

(The meristematic cells of the shoot and root of the plant are totipotent.)

·   जंतुओं की भ्रूणीय Stem cells बहुशक्त होती हैं।

(Embryonic Stem cells of animals are pluripotent.)

·   पादपों में विविभेदन कैलस निर्माण से संबन्धित होता है। वृद्धि कर रही विविभेदित कोशिकाओं के समूह को कैलस कहते हैं।

(Differentiation in plants is related to callus formation. A group of growing differentiated cells is called a callus.)

Inductive Organogenesis (प्रेरक अंगजनन):- It is a plant tissue culture process in which new organs (shoots or roots) are formed from an unorganized mass of cells (callus) or directly from explants after exposure to specific plant growth regulators (PGRs).

[यह एक पादप ऊतक संवर्धन प्रक्रिया है जिसमें विशिष्ट पादप वृद्धि नियामकों (पीजीआर) के संपर्क में आने के बाद कोशिकाओं के एक अव्यवस्थित समूह (कैलस) से या सीधे प्रत्यारोपण से नए अंग (तना या जड़) बनते हैं।]

> Inductive organogenesis is the induction of shoot or root formation in vitro by manipulating the auxin : cytokinin ratio in the culture medium.

(प्रेरक अंगजनन वह प्रक्रिया है जिसमें संवर्धन माध्यम में ऑक्सिन : साइटोकिनिन अनुपात को नियंत्रित करके तना या जड़ निर्माण को प्रेरित किया जाता है।)

> Cells are first stimulated (induced) to become capable of forming organs, and then they differentiate into shoots or roots.

[कोशिकाओं को पहले अंग बनाने में सक्षम होने के लिए उत्तेजित (प्रेरित) किया जाता है, और फिर वे तने या जड़ में विभेदित हो जाती हैं।]

लाभ (Advantages):-

·         कायिक प्रवर्धन की एकांतरित विधि है।

(This is an alternative method of vegetative propagation.)

·         तीव्र विधि है। कम समय में कम जगह पर बहुत अधिक संख्या में पौधे विकसित किए जा सकते हैं।

(This is fast method. A large number of plants can be developed in a small space and least time.)

·         प्ररोह गुणन का 2 – 6 सप्ताहों का एक छोटा चक्र होता है तथा प्रत्येक चक्र में प्ररोहों की संख्या में   लघुगणकीय वृद्धि होती है।

(The shoot multiplication has a short cycle of 2 - 6 weeks and there is a logarithmic increase in the number of shoots in each cycle.)

·         बल्ब, कन्द या घनकन्द उत्पादित पौधों में यह अधिक लाभकारी है क्योंकि छोटे बल्ब, कन्द या घनकन्द पादप गुणन के लिए सम्पूर्ण वर्ष उपलब्ध रहते हैं।

(It is more beneficial in plants producing bulbs, tubers or corms because small bulbs, tubers or corms remain available throughout the year for plant multiplication.)

·         छोटे आकार के प्रवर्ध अधिक लाभकारी होते हैं क्योंकि भंडारण व परिवहन में यह कम जगह घेरते हैं।

(Small sized propagules are more beneficial because they occupy less space in storage and transport.)

·         सूक्ष्म प्रवर्धों का अनुरक्षण मृदा रहित वातावरण में किया जा सकता है जो बड़े स्तर पर इनके भंडारण में सहायता करता है।

(Micro-propagation can be maintained in a soil-free environment, which helps in storing them on a large scale.)

·         स्टॉक पौधों के जननद्रव्य को अनेक वर्षों तक अनुरक्षित किया जा सकता है।

(The germplasm of stock plants can be maintained for many years.)

·         रोग मुक्त पौधों का उत्पादन किया जा सकता है।

(Disease-free plants can be produced.)

·         एकलिंगाश्रयी पौधे (Dioecious plants):- इनकी बीज संततियाँ 50% नर व 50% मादा होती हैं। सूक्ष्म   प्रवर्धन से वांछित संततियाँ (नर या मादा) उत्पन्न की जा सकती हैं।

(Their seed progenies are 50% male and 50% female. Desired offspring (male or female) can be produced by micro propagation.)

·         वाणिज्यिक नर्सरियों में सूक्ष्म प्रवर्धन के लिए कम से कम स्थान की आवश्यकता होती है। संवर्धन ट्यूब्स   में हजारों प्लांटलेट्स को अनुरक्षित किया जा सकता है। यह बागवानी जातियों के अनुरक्षण में उपयोगी है।

(Commercial nurseries require minimal space for micro propagation. Thousands of plantlets can be maintained in culture tubes. It is useful in maintaining horticultural species.)

·         धीमी वृद्धि वाले पौधों में यह विधि अधिक उपयोगी है। ऐसे पौधों में बीज कई वर्षों के पश्चात उत्पन्न होते हैं। इनमें बीज ही केवल प्रवर्ध होते हैं।इस विधि के उपयोग से प्रवर्धों की उपलब्धता में कठिनाई को दूर किया जा   सकता है।

(This method is more useful in slow growth plants. Seeds in such plants are produced after many years. Seeds are only propagules in them. The difficulty in the availability of propagules can be overcome by the use of this method.)

·         बीज उत्पादन से 100% एकसमान संतति उत्पन्न करना हमेशा संभव नहीं है। सूक्ष्म प्रवर्धन के द्वारा   यह संभव है।

(It is not always possible to produce 100% identical offspring from seed production. This is possible through micro propagation.)

·         पुनर्योजी DNA तकनीक या अगुणित संवर्धन या कायिक संकरण द्वारा उत्पन्न नई ऊतक सामग्री का सूक्ष्म प्रवर्धन द्वारा गुणन किया जा सकता है।

(New tissue material developed by recombinant DNA technology or haploid culture or somatic hybridization can be multiplied by micro-propagation.)

दृढ़ीकरण व अनुकूलन (Hardening and Acclimatization):-

•      पौधे को Incubator के अनुकूलित वातावरण से निकालकर green house में स्थानांतरित किया जाता है। जहां पौधे को कुछ प्रतिकूल परिस्थितियों का सामना करना पड़ता है।

(The plant is removed from the adapted environment of the incubator and transferred to the green house. Where the plant has to face some adverse conditions.)

•      15 – 20 दिनों में पौधे green house के वातावरण में अनुकूलित हो जाते है।

(Plants adapt to the green house environment in 15 - 20 days.)

•      अब इन्हें खेत की मृदा में स्थानांतरित करते हैं। यहाँ कुछ दिनों में पौधे अनुकूलित हो जाते है।

(Now they are transferred to the soil of the field. Here the plants get adapted in a few days.)

अंगजनन (Organogenesis):-

1. सामान्य परिचय (General Introduction):-

·     परिभाषा (Definition):- ऊतक संवर्धन में कर्तोतक की कोशिकाओं से अपस्थानिक मूल, तने, पर्ण, पुष्प कलिका आदि के निर्माण की प्रक्रिया को अंगजनन कहते हैं।

(In tissue culture, the process of the formation of the adventitious root, stem, leaf, flower bud etc. from the cells of explant is called organogenesis.)

·     अपस्थानिक (Adventitious):- जब पादप अंग का निर्माण कर्तोतक के ऐसे असामान्य उत्पत्ति बिन्दु से होता है जहाँ पहले से बना हुआ विभज्योतक अनुपस्थित होता है तो इसे अपस्थानिक अंग निर्माण कहते हैं।

(When the plant organ is produced from such an unusual point of origin in the explant where the pre-existing meristem is absent, it is called adventitious organ formation.)

2. महत्वपूर्ण शब्द (Important Terms):-

·     निर्विभेदन (Dedifferentiation):- जब कर्तोतक को माध्यम पर स्थापित किया जाता है तो उसमें कोशिका विभाजन शुरू हो जाता है जिससे अविभेदित कोशिकाओं का एक समूह बनता है जिसे कैलस कहते हैं। कर्तोतक की   कोशिकाएं विभेदित होती हैं जबकि कैलस की कोशिकाएं अविभेदित होती हैं। इस प्रकार विभेदित कोशिकाओं से   अविभेदित कोशिकाओं का निर्माण होता है। यह प्रक्रिया निर्विभेदन कहलाती है।

(When the explant is placed on the medium, cell division begins in it, forming a group of undifferentiated cells called callus. The cells of the explant are differentiated while the cells of the callus are undifferentiated. Thus undifferentiated cells are formed from differentiated cells. This process is called dedifferentiation.)

·     पुनर्विभेदन (Redifferentiation):- कैलस की कुछ कोशिकाएं अंग आध्यकों में विभेदित हो जाती हैं जो विभज्योतक कोशिकाओं को उत्पन्न करते हैं जिनसे पादप के अंगों का निर्माण होता है। इस प्रकार कैलस की   अविभेदित कोशिकाओं के विभेदन से पादप अंगों का निर्माण होता है। इसे पुनर्विभेदन कहते हैं।

(Some cells of the callus differentiate into organ primordia that produce meristematic cells from which plant organs are formed. Thus differentiation of the undifferentiated cells of the callus creates plant organs. This is called redifferentiation.)

·     Caulogenesis:- जब कैलस ऊतक से केवल अपस्थानिक प्ररोह कलिका का निर्माण होता है तो इसे Caulogenesis कहते हैं।

(When only the adventitious shoot is formed from the callus tissue, it is called Caulogenesis.)

·     Rhizogenesis:- जब कैलस ऊतक में केवल अपस्थानिक मूल का निर्माण होता है तो इसे Rhizogenesis कहते हैं।

(When only the adventitious root is formed from the callus tissue, it is called Rhizogenesis.)

·     Organoids:- कभी – कभी अंगजनन के दौरान त्रुटि आ जाने के कारण अनियमित संरचना का निर्माण होता   है जो अंग समान दिखाई देती है। इसे organoid कहते हैं। इसमें अधिचर्मी, संवहनी व भरण ऊतक उपस्थित   होता है। इसका निर्माण कैलस की परिधीय कोशिकाओं से होता है।

(Sometimes an error occurs during organogenesis leading to the formation of irregular structure that looks similar to the organ. This is called organoid. It contains epidermal, vascular and ground tissue. It is formed from peripheral cells of the callus.)

·     Meristemoids:- यह विभज्योतक कोशिकाओं का एक स्थानीय समूह है जो कैलस ऊतक में बनता है तथा जिससे आगे चलकर पादप अंग बनते हैं।

(It is a local group of meristematic cells that are formed in the callus tissue and subsequently form plant organs.)

3. इतिहास (History):-

·     F. Skoog (1944):- इसने बताया कि कृत्रिम अंगजनन रसायनों के द्वारा नियमित होता है। इसने देखा कि   संवर्धन माध्यम में Auxin डालने पर मूल निर्माण प्रेरित होता है तथा प्ररोह निर्माण रुक जाता है।

(He reported that artificial organogenesis is regulated by chemicals. He observed that the addition of Auxin in the culture medium induced the root formation and inhibit shoot formation.)

·     F. Skoog and C. Tsui (1948):- 

इन्होने देखा कि संवर्धन माध्यम में Adenine Sulphate डालने पर प्ररोह निर्माण प्रेरित होता है। अर्थात यह   Auxin के विपरीत प्रभाव डालता है।

(They observed that addition of Adenine Sulphate into the culture medium induced shoot formation. That is, it has the opposite effect of Auxin.)

·     F. Skoog and C. O. Miller (1957):- 

इन्होने एक अवधारणा दी कि अंगजनन Cytokinin व Auxin के मध्य संतुलन से नियंत्रित होता है। Cytokinin   की उच्च मात्रा प्ररोह निर्माण को प्रेरित करती है जबकि Auxin की उच्च मात्रा मूल निर्माण को प्रेरित करती है।

(He gave a concept that organogenesis is controlled by the balance between Cytokinin and Auxin. High amounts of cytokinin induce shoot formation whereas high amounts of auxin induce root formation.)

·     J. G. Torrey (1966):- 

इसने अवधारणा दी कि कैलस ऊतक से अंगजनन की प्रक्रिया विभज्योतक कोशिकाओं के समूह के निर्माण के साथ शुरू होती है। इस समूह को Meristemoid कहते हैं।

(He gave hypothesis that the process of organogenesis from callus tissue begins with the formation of a group of meristematic cells. This group is called Meristemoid.)

·     T. A. Thorpe (1980):- इसने अवधारणा दी कि अन्तर्जात Auxin – Cytokinin संतुलन अंगजनन के   प्रारम्भ में मुख्य कारक है।

(He hypothesized that endogenous Auxin - Cytokinin balance is the main factor in the initiation of organogenesis.)

·     N. Everett (1982):- 

इसने तंबाकू बीजपत्र संवर्धन से प्ररोह कलिका निर्माण को प्रेरित करने के लिए अन्तर्जात Ethylene की एक कारक के रूप में पहचान की थी।

(He identified endogenous ethylene as a factor to induce shoot bud formation from tobacco cotyledon culture.)

4. अंगजनन के प्रकार (Types of Organogenesis):- 

संवर्धन माध्यम में हार्मोन्स के संयोजन के आधार पर अंगजनन 2 प्रकार का होता है। इनके लिए Rule of Thumb का उपयोग किया जाता है।

(Organogenesis is of 2 types depending on the combination of hormones in the culture medium. Rule of Thumb is used for this purpose.)

a. प्रत्यक्ष अंगजनन (Direct Organogenesis)

b. अप्रत्यक्ष अगजनन (Indirect Organogenesis)

a. प्रत्यक्ष अंगजनन (Direct Organogenesis):- 

जब Auxin व Cytokinin की मात्रा में बहुत अधिक अन्तर रखा जाता है तो कर्तोतक से सीधे प्ररोह या मूल का निर्माण होता है। इसे प्रत्यक्ष अंगजनन कहते हैं।

(When there is a huge difference in the amount of Auxin and Cytokinin, the shoot or root is directly formed from the explant. This is called direct organogenesis.)

अनेक पौधों में कैलस के उप संवर्धन से अवांछित कायिक क्लोनीय विविधताएँ विकसित हो जाती हैं। इससे बचने   के लिए प्रत्यक्ष अंगजनन किया जाता है।

(In many plants, undesirable soma-clonal variations develop by sub-culturing the callus. To avoid this, direct organogenesis is done.)

b. अप्रत्यक्ष अगजनन (Indirect Organogenesis):- 

जब Auxin व Cytokinin की मात्रा को लगभग समान रखा जाता है तो कर्तोतक से कैलस का निर्माण होता है। कैलस से फिर अंग निर्माण को प्रेरित किया जाता है। इसे अप्रत्यक्ष अंगजनन कहते हैं।

(When the amount of Auxin and Cytokinin is kept almost the same, callus is formed from the explant. Callus is then induced for organ formation. This is called indirect organogenesis.)

5. अंगजनन को प्रभावित करने वाले कारक (Factors Affecting Organogenesis):-

a. भौतिक कारक (Physical Factors)

b. रासायनिक कारक (Chemical Factors)

a. भौतिक कारक (Physical Factors):-

i. प्रकाश की गुणवत्ता (Quality of Light):- 

नीला प्रकाश प्ररोह निर्माण को प्रेरित करता है जबकि लाल प्रकाश मूल निर्माण को प्रेरित करता है।

(Blue light induces shoot formation while red light induces root construction.)

ii. तापमान (Temperature):- 33°C तक तापमान में वृद्धि करने पर तंबाकू में कैलस की वृद्धि बढ़ जाती है। परन्तु प्ररोह कलिका विभेदन के लिए कम तापमान 18°C उपयुक्त होता है।

(Increasing the temperature up to 33 °C increases the callus growth in tobacco. But low temperature 18 ° C is suitable for shoot bud differentiation.)

b. रासायनिक कारक (Chemical Factors):-

i. पादप हार्मोन्स (Plant Hormones):- Cytokinin प्ररोह कलिका निर्माण को प्रेरित करता है। Auxin मूल   निर्माण को प्रेरित करता है। Cytokinin में Adenine की तुलना में Kinetin 30,000 गुना अधिक प्रभावी होता है।

(Cytokinin induces shoot bud formation. Auxin induces the root formation. Kinetin is 30,000 times more effective than adenine in cytokinins.)

ii. औक्सिन अवरोधक (Auxin Inhibitors):- 

माध्यम में उपस्थित होने पर ये Auxin के प्रभाव को रोक देते हैं अर्थात प्ररोह निर्माण को प्रेरित करता है।

(When present in the medium, they inhibit the effect of Auxin, it means induces shoot formation.)

उदाहरण (Examples):-

Ø  फॉस्फेट (Phosphate)

Ø  कैसीन हाइड्रोलाइसेट (Casein Hydrolysate)

Ø  टायरोसिन (Tyrosine)

Ø  ऐडेनिन (Adenine)

Ø  फिनोलिक यौगिक (Phenolic Compounds)

Ø  कीलेटिंग कारक (Chelating agents)

Ø  ऐब्सिसिक अम्ल (Abscisic Acid)

6. लाभ (Advantages):-

·     सस्ता (Cheap)

·     तीव्र प्रक्रिया (Fast Process)

·     विभिन्नता रहित (No variables)

·     कम स्थान (Less Space)

·     आसानी विधि (Easily Scale)

7. अनुप्रयोग (Applications):-

·     एक Bioreactor की तरह उपयोग करते हैं।

(It is used as a bioreactor.)

·     प्रोटोप्लास्ट संवर्धन (Protoplast Culture)

·     जीन स्थानांतरण (Gene Transfer)

Morphogenetic factors for in vitro regeneration:- Morphogenesis in culture proceeds along a number of pathways. Of them, two are major pathways - organogenesis and somatic embryogenesis. Organogenesis includes direct genesis of adventitious shoots or roots and indirectly via callusing. Embryogenesis also possesses two pathways where the outcome differs in the form "bipolar somatic embryos" which in later stage form individual plantlets. Several factors influence the phenomenon of morphogenesis considerably during culture. 

1. Genotype:- In the plant kingdom, certain plant groups appeared to respond more readily in culture than others. Members of carrot family (Umbelliferae) are considered to be a group that can readily form somatic embryos in culture. However, differences in response were observed among the different species of a genus and different cultivars in a species. It is now well accepted that genetic factors contribute to the response of plant tissues in culture. Though there are reports of recalcitrance among plant species to culture, this problem can be successfully overcome by manipulation of explants, culture medium or culture environment.

2. Explant:- Although all cells in a plant are considered totipotent, there are striking differences from cell to cell and from organ to organ within a plant to regenerate plants. In general, embryonic, meristematic and reproductive tissues appear to have greater potential for growth and morphogenesis in culture. For woody species, it is possible to regenerate some types of organs only when embryos or young inflorescences are cultured. The inoculum must comprise actively dividing cells or juvenile cells. It is a well known fact that physiological stage of the mother plant, its nutritional and environmental conditions would also affect the explant for morphogenesis. So the mother plant should be grown in a well controlled environment to get reproducible results even though some changes in endogenous rhythm are not avoidable.

3. Growth regulators:- It is known that the control of morphogenesis in the majority of the cultures is largely a function of the exogenous auxin/cytokinin ratio. High concentrations of kinetin cause shoot initiation, whereas high levels of auxin favour rooting. In somatic embryogenesis, auxin is required for induction of embryonic cells and maintenance of proliferative growth. Embryo formation can be induced by transferring the callus to less auxin medium or a medium lacking auxin. Plant growth regulators other than auxins and cytokinins have been shown to play an important role in the induction and control of morphogenesis. Gibberellic acid has been used most successfully to obtain rapid growth

of shoot apices and somatic embryos into plants.

4. Nutrient medium:- Components of nutrient medium play critical roles in controlling morphogenesis in culture. Effects of many inorganic and organic nutrients have been studied extensively. One of the most important components of the medium in effecting morphogenesis is the source and concentration of nitrogen. Supply of high levels of reduced nitrogen appears suitable to shoot formation and essential to somatic embryogenesis. This is supplied in the form of ammonium nitrate and sometimes substituted with amino acids such as glutamine, glycine and alanine and their amides. Presence of potassium in the medium enhances embryogenesis.

5. Other additives:- Supplementation of medium with casein hydrolysate and coconut milk also favour the morphogenesis in vitro. Coconut milk has been employed extensively as a medium component for somatic embryogenesis.

6. Culture environment:- Temperature, photoperiod, light intensity and osmotic concentration are other factors that may have determining role in organogenesis and embryogenesis. The optimum temperature for culture is 24 ± 2oC. Low temperature treatment of explants prior to culture favours their regenerative ability. Light also exerts a strong morphogenetic effect on plants in culture. Usually cultures produce shoots but the period of lighting should be maintained according to the photoperiodism of normal environment. The blue region of the spectrum promotes shoot formation and red light favours rooting. In the light, the somatic embryos of carrot formed plants; in the absence of light etiolation occurred. Overall osmotic concentration of a medium can also exert a profound effect on morphogenesis. Increased osmotic levels in medium enhance shoot and somatic embryo formation. The osmotic level can be increased by adding additional sucrose.

इन विट्रो पुनर्जनन के लिए आकारजनन कारक:-  संवर्धित में आकारजनन कई मार्गों से आगे बढ़ता है। इनमें से दो प्रमुख मार्ग हैं - अंगजनन और दैहिक भ्रूणजनन। अंगजनन में आकस्मिक शाखाओं या जड़ों का प्रत्यक्ष निर्माण और कैलस निर्माण के माध्यम से अप्रत्यक्ष निर्माण शामिल है। भ्रूणजनन में भी दो मार्ग होते हैं, जिनमें परिणाम "द्विध्रुवीय दैहिक भ्रूण" के रूप में भिन्न होते हैं, जो बाद के चरण में अलग-अलग पौधे बनाते हैं। संवर्धित के दौरान आकारजनन की घटना को कई कारक काफी हद तक प्रभावित करते हैं। 

1. जीनोटाइप:-  पादप जगत में, कुछ पादप समूह अन्य समूहों की तुलना में संवर्धन में अधिक सहजता से प्रतिक्रिया करते प्रतीत होते हैं। गाजर कुल (अम्बेलीफेरी) के सदस्य ऐसे समूह माने जाते हैं जो संवर्धन में आसानी से कायिक भ्रूण बना सकते हैं। हालांकि, एक ही वंश की विभिन्न प्रजातियों और एक ही प्रजाति की विभिन्न किस्मों में प्रतिक्रिया में अंतर देखा गया है। अब यह सर्वमान्य है कि आनुवंशिक कारक संवर्धन में पादप ऊतकों की प्रतिक्रिया में योगदान करते हैं। यद्यपि कुछ पादप प्रजातियों में संवर्धन के प्रति प्रतिरोध की रिपोर्टें हैं, इस समस्या को एक्सप्लांट, संवर्धन माध्यम या संवर्धन वातावरण में हेरफेर करके सफलतापूर्वक दूर किया जा सकता है।

2. प्रत्यारोपण (एक्सप्लांट):- यद्यपि पौधे की सभी कोशिकाओं को सर्वगुण संपन्न माना जाता है, फिर भी पौधों के पुनर्जनन के लिए कोशिका-कोशिका और अंग-अंग में उल्लेखनीय अंतर पाए जाते हैं। सामान्यतः, भ्रूण, मेरिस्टेमेटिक और प्रजनन ऊतकों में संवर्धन में वृद्धि और आकारिक विकास की अधिक क्षमता पाई जाती है। काष्ठ प्रजातियों के लिए, कुछ प्रकार के अंगों का पुनर्जनन केवल भ्रूण या युवा पुष्पक्रमों के संवर्धन से ही संभव है। इनोक्यूलम में सक्रिय रूप से विभाजित होने वाली कोशिकाएँ या किशोर कोशिकाएँ होनी चाहिए। यह सर्वविदित तथ्य है कि मातृ पौधे की शारीरिक अवस्था, उसकी पोषण संबंधी और पर्यावरणीय परिस्थितियाँ भी आकारिक विकास के लिए प्रत्यारोपण को प्रभावित करती हैं। इसलिए मातृ पौधे को अच्छी तरह से नियंत्रित वातावरण में उगाया जाना चाहिए ताकि पुनरुत्पादक परिणाम प्राप्त हो सकें, भले ही आंतरिक लय में कुछ परिवर्तन अपरिहार्य हों।

3. वृद्धि नियामक:- यह ज्ञात है कि अधिकांश कल्चर में मॉर्फोजेनेसिस का नियंत्रण काफी हद तक बाह्य ऑक्सिन/साइटोकिनिन अनुपात पर निर्भर करता है। काइनेटिन की उच्च सांद्रता शूट निर्माण को प्रेरित करती है, जबकि ऑक्सिन का उच्च स्तर जड़ निर्माण को बढ़ावा देता है। कायिक भ्रूणजनन में, भ्रूण कोशिकाओं के प्रेरण और प्रवर्धन वृद्धि के रखरखाव के लिए ऑक्सिन आवश्यक है। भ्रूण निर्माण को कैलस को कम ऑक्सिन वाले माध्यम या ऑक्सिन रहित माध्यम में स्थानांतरित करके प्रेरित किया जा सकता है। ऑक्सिन और साइटोकिनिन के अलावा अन्य पादप वृद्धि नियामकों को मॉर्फोजेनेसिस के प्रेरण और नियंत्रण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हुए दिखाया गया है। तीव्र वृद्धि प्राप्त करने के लिए जिबरेलिक अम्ल का सबसे सफल उपयोग किया गया है।

तना शीर्षों और दैहिक भ्रूणों का पौधों में रूपांतरण।

4. पोषक माध्यम:- पोषक माध्यम के घटक संवर्धन में आकारिकी को नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। कई अकार्बनिक और कार्बनिक पोषक तत्वों के प्रभावों का व्यापक अध्ययन किया गया है। आकारिकी को प्रभावित करने वाले माध्यम के सबसे महत्वपूर्ण घटकों में से एक नाइट्रोजन का स्रोत और सांद्रता है। उच्च स्तर पर अपचयित नाइट्रोजन की आपूर्ति शूट निर्माण के लिए उपयुक्त और कायिक भ्रूणजनन के लिए आवश्यक प्रतीत होती है। यह अमोनियम नाइट्रेट के रूप में प्रदान की जाती है और कभी-कभी ग्लूटामिन, ग्लाइसिन और एलानिन जैसे अमीनो अम्लों और उनके एमाइड्स से प्रतिस्थापित की जाती है। माध्यम में पोटेशियम की उपस्थिति भ्रूणजनन को बढ़ाती है।

5. अन्य योजक:- माध्यम में केसिन हाइड्रोलाइज़ेट और नारियल दूध का पूरक भी इन विट्रो में आकारिकी विकास को बढ़ावा देता है। नारियल दूध का उपयोग कायिक भ्रूणजनन के लिए एक माध्यम घटक के रूप में व्यापक रूप से किया गया है।

6. संवर्धन वातावरण: तापमान, प्रकाश अवधि, प्रकाश की तीव्रता और परासरण सांद्रण अन्य कारक हैं जो अंग निर्माण और भ्रूणजनन में निर्णायक भूमिका निभा सकते हैं। संवर्धन के लिए इष्टतम तापमान 24 ± 2°C है। संवर्धन से पहले एक्सप्लांट्स को कम तापमान पर उपचारित करने से उनकी पुनर्जनन क्षमता बढ़ती है। प्रकाश भी संवर्धन में पौधों पर प्रबल आकारिक प्रभाव डालता है। आमतौर पर संवर्धन से अंकुर उत्पन्न होते हैं, लेकिन प्रकाश की अवधि को सामान्य वातावरण के प्रकाश अवधि के अनुसार बनाए रखना चाहिए। स्पेक्ट्रम का नीला क्षेत्र अंकुर निर्माण को बढ़ावा देता है और लाल प्रकाश जड़ निर्माण में सहायक होता है। प्रकाश में, गाजर के कायिक भ्रूणों ने पौधे बनाए; प्रकाश की अनुपस्थिति में परासरण हुआ। माध्यम की समग्र परासरण सांद्रण भी आकारिकीकरण पर गहरा प्रभाव डाल सकती है। माध्यम में बढ़े हुए परासरण स्तर से अंकुर और कायिक भ्रूण निर्माण में वृद्धि होती है। अतिरिक्त सुक्रोज मिलाकर परासरण स्तर को बढ़ाया जा सकता है।

Management of micro propagated plants in laboratory and net houses:-

 Development of plants in growth room:-

> After the inoculation of the plant tissue, the bottles are sealed and transferred into growth room to trigger developmental process under diffused light (fluorescent light of 1000-2000 lux) at 25 ± 2oC and 50 to 60% relative humidity. Light and temperature requirements vary from species to species and sometimes during the various stages of developments.

> The cultures are observed daily for growth and any signs of infection / contamination. Cultures, that do not show good growth or infected, are discarded. The healthy cultures grow into small shoot buds. These are subcultured on the fresh medium after 4 weeks. 

> The number of subcultures required is specific to the plant species, which are standardized. The shoots generally develop after 4 weeks. After enough number of shoots is developed in each container (10 to 15), to a minimum height of 2 cm they are transferred to another medium for initiating the process of rooting. The constituent of rooting medium for each plant species are specific. Roots are generally formed within 2 to 4 weeks. Plants at this stage are delicate and require careful handling. 

Hardening of micro plants:- 

> Due to very high humidity inside the culture vessel and artificial conditions of development, the plantlets are tender and are therefore are not ready for coping up with the filed conditions. The plants removed from the sterile medium are washed and are maintained under intermittent mist or are covered with clean transparent plastic. 

> After 10 to 15 days under high humidity, the plants are transferred to green house and maintained for another 4 to 6 weeks. They are then ready to be transferred to net house or the field. Normally, the tissue culture plants are sold either as ex-agar plants or hardened plants from the green house. 

1. Ex-agar plants:- 

- Depending on the parameters such as location/the site of planting, soil quality and the climatic conditions defined by the customer, the ex-agar plant for sale could be in vitro rooted plants or only the shoots. When the tissue culture plants are sold at this stage, the plants are washed in sterilized water to remove the agar medium.

- The washed plants are sorted into 2 to 3 grades and packed in corrugated plastic boxes lined with sterilized tissue paper as per specifications of the Plant Quarantine Authority, Government of India for exports. The number of plants per box depends on the customer’s requirement. Depending on the final destination and the preference of the customer, the plants are treated with specific fungicides and antibiotics to avoid infection.

- The ex-agar plants are preferred for export or for destinations where hardening facility are available. The plants after being removed from nutrient media should preferably be transplanted within 72 hours.

2. Hardened plants:-

- The plants are transferred to net pots/ pro tray for acclimatization after they fully develop shoots and roots in the bottles. The rooted plantlets are transferred to pots filled with suitable substrate and are watered. This operation is carried out on an open bench. 

- These pots are then transferred to the green house for 4 to 6 weeks. During this process, they are given fertilizers and treated like plantlets obtained by any other means of propagation. 

- After the plants are acclimatized fully, they are transferred to poly-bags. At this stage the plants are completely hardened and are ready to be planted in the field for cultivation. 

- Hardening units can be set up in sites away from the micro-propagation unit.

प्रयोगशाला और नेट हाउस में सूक्ष्म प्रवर्धन द्वारा उगाए गए पौधों का प्रबंधन:-

 वृद्धि कक्ष में पौधों का विकास:-

पौधे के ऊतकों में इनोक्यूलेशन के बाद, बोतलों को सील कर दिया जाता है और विकास प्रक्रिया शुरू करने के लिए उन्हें विसरित प्रकाश (1000-2000 लक्स का फ्लोरोसेंट प्रकाश) में 25 ± 2°C तापमान और 50 से 60% सापेक्ष आर्द्रता पर वृद्धि कक्ष में स्थानांतरित कर दिया जाता है। प्रकाश और तापमान की आवश्यकताएं प्रजातियों के अनुसार और कभी-कभी विकास के विभिन्न चरणों में भिन्न होती हैं।

कल्चर की वृद्धि और संक्रमण/संदूषण के किसी भी लक्षण के लिए प्रतिदिन निगरानी की जाती है। जिन कल्चर में अच्छी वृद्धि नहीं होती या जो संक्रमित होते हैं, उन्हें हटा दिया जाता है। स्वस्थ कल्चर छोटे अंकुरों में विकसित होते हैं। इन्हें 4 सप्ताह बाद ताजे माध्यम पर उप-संवर्धन किया जाता है। 

आवश्यक उपसंवर्धनों की संख्या पौधे की प्रजाति के अनुसार अलग-अलग होती है, जिन्हें मानकीकृत किया जाता है। अंकुर आमतौर पर 4 सप्ताह बाद विकसित होते हैं। प्रत्येक गमले में पर्याप्त संख्या में अंकुर (10 से 15) कम से कम 2 सेंटीमीटर की ऊंचाई तक विकसित होने के बाद, उन्हें जड़ विकास की प्रक्रिया शुरू करने के लिए दूसरे माध्यम में स्थानांतरित कर दिया जाता है। प्रत्येक पौधे की प्रजाति के लिए जड़ विकास माध्यम के घटक विशिष्ट होते हैं। जड़ें आमतौर पर 2 से 4 सप्ताह में बन जाती हैं। इस अवस्था में पौधे नाजुक होते हैं और उन्हें सावधानीपूर्वक संभालने की आवश्यकता होती है। 

सूक्ष्म पौधों का सख्तीकरण:- 

संवर्धन पात्र के भीतर अत्यधिक आर्द्रता और कृत्रिम विकास परिस्थितियों के कारण, पौधे नाजुक होते हैं और इसलिए खेत की परिस्थितियों के अनुकूल होने के लिए तैयार नहीं होते हैं। रोगाणु रहित माध्यम से निकाले गए पौधों को धोया जाता है और उन्हें रुक-रुक कर पानी की फुहार के नीचे रखा जाता है या साफ पारदर्शी प्लास्टिक से ढक दिया जाता है। 

उच्च आर्द्रता में 10 से 15 दिनों तक रखने के बाद, पौधों को ग्रीनहाउस में स्थानांतरित कर दिया जाता है और 4 से 6 सप्ताह तक वहीं रखा जाता है। इसके बाद वे नेट हाउस या खेत में स्थानांतरित करने के लिए तैयार हो जाते हैं। आमतौर पर, ऊतक संवर्धन से प्राप्त पौधों को ग्रीनहाउस से प्राप्त एक्स-अगर पौधों या कठोर किए गए पौधों के रूप में बेचा जाता है। 

1. एक्स-अगर पौधे:- 

ग्राहक द्वारा निर्धारित स्थान/रोपण स्थल, मिट्टी की गुणवत्ता और जलवायु परिस्थितियों जैसे मापदंडों के आधार पर, बिक्री के लिए उपलब्ध एक्स-अगर पौधे इन विट्रो रूटेड पौधे या केवल शूट हो सकते हैं। इस अवस्था में टिशू कल्चर पौधों की बिक्री के दौरान, अगर माध्यम को हटाने के लिए उन्हें रोगाणुरहित पानी से धोया जाता है।

धोए गए पौधों को 2 से 3 श्रेणियों में छाँटा जाता है और निर्यात के लिए भारत सरकार के पादप संगरोध प्राधिकरण के निर्देशों के अनुसार रोगाणुरहित टिशू पेपर से ढके नालीदार प्लास्टिक के बक्सों में पैक किया जाता है। प्रति बॉक्स पौधों की संख्या ग्राहक की आवश्यकता पर निर्भर करती है। अंतिम गंतव्य और ग्राहक की पसंद के आधार पर, संक्रमण से बचाव के लिए पौधों को विशिष्ट फफूंदनाशकों और एंटीबायोटिक दवाओं से उपचारित किया जाता है।

- निर्यात के लिए या उन स्थानों के लिए जहां पौधों को मजबूत बनाने की सुविधा उपलब्ध है, एक्स-अगर पौधों को प्राथमिकता दी जाती है। पोषक माध्यम से निकालने के बाद पौधों को अधिमानतः 72 घंटों के भीतर रोपित कर देना चाहिए।

2. कठोरीकृत पौधे:-

- जब पौधे बोतलों में पूरी तरह से अंकुर और जड़ें विकसित कर लेते हैं, तो उन्हें अनुकूलन हेतु जालीदार गमलों/प्रो ट्रे में स्थानांतरित कर दिया जाता है। जड़युक्त पौधों को उपयुक्त मिट्टी से भरे गमलों में स्थानांतरित करके पानी दिया जाता है। यह प्रक्रिया खुली सतह पर की जाती है। 

- इसके बाद इन गमलों को 4 से 6 सप्ताह के लिए ग्रीनहाउस में स्थानांतरित कर दिया जाता है। इस प्रक्रिया के दौरान, उन्हें उर्वरक दिए जाते हैं और अन्य तरीकों से उगाए गए पौधों की तरह ही उनकी देखभाल की जाती है। 

पौधों के पूरी तरह से अनुकूलित हो जाने के बाद, उन्हें पॉली-बैग में स्थानांतरित कर दिया जाता है। इस अवस्था में पौधे पूरी तरह से कठोर हो जाते हैं और खेती के लिए खेत में रोपने के लिए तैयार हो जाते हैं। 

- माइक्रो-प्रोपेगेशन यूनिट से दूर स्थानों पर हार्डनिंग यूनिट स्थापित की जा सकती हैं।

Micro propagation technology (सूक्ष्म प्रवर्धन प्रौधौगिकी):-

1. सामान्य परिचय (General Introduction):-

·         क्लोनीय प्रवर्धन (Clonal Propagation):- अलैंगिक जनन द्वारा एक पौधे की आनुवांशिक रूप से एक समान संततियाँ उत्पन्न करके गुणन करने की प्रक्रिया को क्लोनीय प्रवर्धन कहते हैं।

(The process of multiplication by producing genetically identical offspring of a plant by asexual reproduction is called clonal propagation.)

·         प्राकृतिक क्लोनीय प्रवर्धन अधिक कठिन, खर्चीला व असफल होता है।

(Natural clonal propagation is more difficult, expensive, and unsuccessful.)

·         परिभाषा (Definition):- पादप के कायिक भाग को कर्तोतक के समान उपयोग करके निर्जमित परिस्थितियों में कृत्रिम माध्यम पर संवर्धन करने की प्रक्रिया को सूक्ष्म प्रवर्धन कहते हैं। अर्थात क्लोनीय प्रवर्धन की कृत्रिम   विधि को सूक्ष्म प्रवर्धन कहते हैं।

(The process of culturing the vegetative part of the plant as explant on culture medium under sterilized conditions is called micro propagation. That is, the artificial method of clonal propagation is called micro propagation.)

·         क्लोन शब्द का प्रयोग सबसे पहले Weber ने किया था।

(The term clone was first used by Weber.)

·         सूक्ष्म प्रवर्धन में बहुत कम जगह और बहुत कम समय में एक पौधे से बहुत अधिक संख्या में सूक्ष्म कायिक प्ररोह बना लिए जाते हैं।

(Very large number of minute vegetative shoots are produced from a plant in very little space and in a very short time in micro propagation.)

·         सूक्ष्म प्रवर्धन के लिए ऊतक संवर्धन का उपयोग G. Morel ने 1960 में शुरू किया था। उसने ओर्किड   प्रवर्धन के लिए इसका उपयोग किया था।

(The use of tissue culture for micro-propagation started in 1960 by G. Morel. He used it for orchid propagation.)

2. सूक्ष्म प्रवर्धन विधियाँ (Micro propagation Methods):-

i. प्ररोह शीर्षस्थ विभाज्योतक द्वारा गुणन (Multiplication by Shoot Apical Meristem)

ii. अपस्थानिक प्ररोह द्वारा गुणन (Multiplication by Adventitious Shoot)

iii. अपस्थानिक भ्रूण निर्माण द्वारा गुणन (Multiplication by Adventitious Embryo Formation)

iv. कैलस संवर्धन द्वारा गुणन (Multiplication by Callus Culture)

3. सूक्ष्म प्रवर्धन की अवस्थाएँ (Stages of Micro propagation):- 

सूक्ष्म प्रवर्धन को 5 अवस्थाओं में विभाजित किया गया है –

(Micro propagation is divided into 5 stages -)

a. अवस्था – 0 (Stage - 0)

b. अवस्था – I (Stage - I)

c. अवस्था – II (Stage - II)

d. अवस्था – III (Stage - III)

e. अवस्था – IV (Stage - IV)

a. अवस्था – 0 (Stage - 0):- 

यह सूक्ष्म प्रवर्धन का प्रारम्भिक चरण है जिसमें स्टॉक पौधों का चयन करके लगभग 3 महीने के लिए नियंत्रित परिस्थितियों में उगाया जाता है। जिससे पौधे पूर्ण रूप से स्वस्थ व ओजपूर्ण हो जाते हैं।

(This is the initial stage of micro propagation in which stock plants are selected and grown under controlled conditions for about 3 months. Due to which the plant becomes completely healthy and vigorous.)

b. अवस्था – I (Stage - I):-

·         इस अवस्था में स्वस्थ पौधे से कर्तोतक को लेकर उपयुक्त संवर्धन माध्यम पर स्थापित कर दिया जाता है।

(In this stage, the explants are taken from a healthy plant and are established on the appropriate culture medium.)

·         सूक्ष्म प्रवर्धन के लिए मुख्यत: 2 माध्यम उपयुक्त होते हैं –

(There are mainly 2 mediums suitable for micro propagation -)

i. MS माध्यम (MS medium)

ii. White माध्यम (White medium)

·         इस अवस्था में निम्न चरण होते हैं –

(This stage consists of the following steps -)

i. कर्तोतक का पृथक्करण (Isolation of Explant)

ii. सतही निर्जमीकरण (Surface Sterilization)

iii. सफाई (Washing)

iv. उपयुक्त संवर्धन माध्यम पर कर्तोतक की स्थापना (Establishment of Explant on Appropriate Culture Medium)

·         इस अवस्था में माध्यम में Kinetin व NAA या IBA वृद्धि नियामक मिश्रित किए जाते हैं जो वृद्धि व विकास को प्रेरित करते हैं।

(At this stage, kinetin and NAA or IBA growth regulators are mixed in the medium to induce growth and development.)

c. अवस्था – II (Stage - II):-   इस अवस्था में सूक्ष्म प्रवर्धन की मुख्य क्रिया होती है। इसमें कर्तोतक की वृद्धि   होती है तथा भ्रूण का निर्माण होता है।

(In this stage, the main activity of micro propagation takes place. In this, there is growth of explant and formation of embryo occurs.)

d. अवस्था – III (Stage - III):-

·         कर्तोतक के भ्रूण में परिवर्तन के दौरान माध्यम में उपस्थित पोषक पदार्थों का उपयोग हो जाता है, जिससे भ्रूण का आगे का परिवर्धन धीमा हो जाता है।

(During development of embryo from explant, nutrients present in the medium are used, which further slows down the embryo's further development.)

·         इसलिए इस अवस्था में हम भ्रूण को पुराने माध्यम से निकालकर नए माध्यम में स्थानांतरित कर देते हैं ताकि भ्रूण शीघ्रता से प्ररोह में विकसित हो सके। इसे उप – संवर्धन भी कहते हैं।

(Therefore, in this stage we remove the embryo from the old medium and transfer it to the new medium so that the embryo can develop into shoots quickly. It is also called sub-culturing.)

·         इस अवस्था में माध्यम में Kinetin की उच्च मात्रा डालते हैं।

(In this stage high amount of kinetin is added to the medium.)

·         तापमान 24 – 26°C रखा जाता है तथा प्रकाश की तीव्रता कम राखी जाती है।

(The temperature is kept at 24 - 26 ° C and the intensity of light is kept low.)

·         नए माध्यम में भ्रूण का शीघ्रता से प्ररोह में विकास हो जाता है जिससे प्लांटलेट्स बन जाते हैं।

(In the new medium, the embryo develops quickly in shoots, forming plantlets.)

e. अवस्था – IV (Stage - IV):-

·         इस अवस्था में हम प्लांटलेट्स को आगे के परिवर्धन के लिए मृदा में स्थापित करते हैं।

(In this stage we establish the plantlets in the soil for further development.)

·         हम प्लांटलेट्स को लैब के वातावरण से निकालकर ग्रीन हाउस के वातावरण में स्थानांतरित करते हैं। जहां   इनकी हार्डनिंग की जाती है।

(We transfer the plantlets from the lab environment to the greenhouse environment. Where they are hardened.)

4. लाभ (Advantages):-

·         कायिक प्रवर्धन की एकांतरित विधि है।

(This is an alternative method of vegetative propagation.)

·         तीव्र विधि है। कम समय में कम जगह पर बहुत अधिक संख्या में पौधे विकसित किए जा सकते हैं।

(This is fast method. A large number of plants can be developed in a small space and least time.)

·         प्ररोह गुणन का 2 – 6 सप्ताहों का एक छोटा चक्र होता है तथा प्रत्येक चक्र में प्ररोहों की संख्या में   लघुगणकीय वृद्धि होती है।

(The shoot multiplication has a short cycle of 2 - 6 weeks and there is a logarithmic increase in the number of shoots in each cycle.)

·         बल्ब, कन्द या घनकन्द उत्पादित पौधों में यह अधिक लाभकारी है क्योंकि छोटे बल्ब, कन्द या घनकन्द पादप गुणन के लिए सम्पूर्ण वर्ष उपलब्ध रहते हैं।

(It is more beneficial in plants producing bulbs, tubers or corms because small bulbs, tubers or corms remain available throughout the year for plant multiplication.)

·         छोटे आकार के प्रवर्ध अधिक लाभकारी होते हैं क्योंकि भंडारण व परिवहन में यह कम जगह घेरते हैं।

(Small sized propagules are more beneficial because they occupy less space in storage and transport.)

·         सूक्ष्म प्रवर्धों का अनुरक्षण मृदा रहित वातावरण में किया जा सकता है जो बड़े स्तर पर इनके भंडारण में सहायता करता है।

(Micro-propagation can be maintained in a soil-free environment, which helps in storing them on a large scale.)

·         स्टॉक पौधों के जननद्रव्य को अनेक वर्षों तक अनुरक्षित किया जा सकता है।

(The germplasm of stock plants can be maintained for many years.)

·         रोग मुक्त पौधों का उत्पादन किया जा सकता है।

(Disease-free plants can be produced.)

·         एकलिंगाश्रयी पौधे (Dioecious plants):- इनकी बीज संततियाँ 50% नर व 50% मादा होती हैं। सूक्ष्म   प्रवर्धन से वांछित संततियाँ (नर या मादा) उत्पन्न की जा सकती हैं।

(Their seed progenies are 50% male and 50% female. Desired offspring (male or female) can be produced by micro propagation.)

·         वाणिज्यिक नर्सरियों में सूक्ष्म प्रवर्धन के लिए कम से कम स्थान की आवश्यकता होती है। संवर्धन ट्यूब्स   में हजारों प्लांटलेट्स को अनुरक्षित किया जा सकता है। यह बागवानी जातियों के अनुरक्षण में उपयोगी है।

(Commercial nurseries require minimal space for micro propagation. Thousands of plantlets can be maintained in culture tubes. It is useful in maintaining horticultural species.)

·         धीमी वृद्धि वाले पौधों में यह विधि अधिक उपयोगी है। ऐसे पौधों में बीज कई वर्षों के पश्चात उत्पन्न होते हैं। इनमें बीज ही केवल प्रवर्ध होते हैं।इस विधि के उपयोग से प्रवर्धों की उपलब्धता में कठिनाई को दूर किया जा   सकता है।

(This method is more useful in slow growth plants. Seeds in such plants are produced after many years. Seeds are only propagules in them. The difficulty in the availability of propagules can be overcome by the use of this method.)

·         बीज उत्पादन से 100% एकसमान संतति उत्पन्न करना हमेशा संभव नहीं है। सूक्ष्म प्रवर्धन के द्वारा   यह संभव है।

(It is not always possible to produce 100% identical offspring from seed production. This is possible through micro propagation.)

·         पुनर्योजी DNA तकनीक या अगुणित संवर्धन या कायिक संकरण द्वारा उत्पन्न नई ऊतक सामग्री का सूक्ष्म प्रवर्धन द्वारा गुणन किया जा सकता है।

(New tissue material developed by recombinant DNA technology or haploid culture or somatic hybridization can be multiplied by micro-propagation.)

Plant tissue culture: A historical perspective (पादप ऊतक संवर्धन: एक ऐतिहासिक परिप्रेक्ष्य)

पादप ऊतक संवर्धन का इतिहास (History of Plant Tissue Culture):-

·         Haberlandt (1902):- "कायिक कोशिकाओं से भ्रूण का विकास संभव है। ’’ यह विचार इनके द्वारा 1902 में दिया गया था। इन्होंने Lamium purpureum की परिपक्व पर्ण की कोशिकाओं और Tradescantia व Pulmonaria की रोम कोशिकाओं को 1 - 5% सुक्रोज युक्त नौप के विलयन में संवर्धित करने का प्रयास किया परन्तु सफलता नहीं मिली।

(‘’It is possible to grow embryos from somatic cells.’’ This idea was visualized by him in 1902. He tried to grow the mature leaf cells of Lamium purpureum and hair cells of Tradescantia and Pulmonaria in knop’s solution containing 1 – 5% sucrose without success.)

·         Robbins and Kotte (1922):- इन्होने स्वतंत्र रूप से सीमित अवधि के लिए मक्का और मटर के मूल शिखाग्र को संवर्धित करने में सफलता प्राप्त की थी।

(They independently were able to grow the root tips of maize and pea for a limited period.)

·         White (1922):- इन्होंने अकार्बनिक लवण, खमीर निष्कर्ष और सुक्रोज युक्त द्रव माध्यम में टमाटर (Lycopersicum esculentum) के मूल शिखाग्र को सतत रूप से लम्बी अवधि तक संवर्धित करने में सफलता प्राप्त की थी।

[He successfully grew the root tips of tomato (Lycopersicum esculentum) continuously for a prolonged period in liquid medium containing inorganic salts, yeast extract and sucrose.]

·         Kogl (1934):- इन्होंने बताया कि Went (1926) द्वारा खोजा गया वृद्धि पदार्थ IAA (इंडोल एसिटिक एसिड) था।

[He reported that the growth substance invented by Went (1926) was IAA (Indole Acetic Acid).]

·         Snow (1935):- इन्होंने एधा सक्रियता को उत्तेजित करने के लिए IAA की क्षमता का प्रदर्शन किया।

(He demonstrated the ability of IAA to stimulate cambial activity.)

·         White, Nobecourt and Goutheret (1939):- इन्होंने साथ साथ और स्वतंत्र रूप से टमाटर, Salix capraea व Populus nigra के कैलस संवर्धनों को लम्बी अवधि के लिए स्थापित करने में सफलता प्राप्त की।

(They simultaneously and independently reported establishment of tomato, Salix capraea and Populus nigra callus cultures for prolonged period.)

·         Nobecourt (1939):- इन्होंने गाजर के कैलस संवर्धनों में मूल विभेदन को देखा।

(He reported the differentiation of roots in callus cultures of carrot.)

·         White (1939):- इन्होंने तम्बाकू के प्ररोह संवर्धनों में सफलतापूर्वक पर्णीय प्ररोह कलिकायों को प्रेरित किया।

(He successfully induced leafy shoot buds in tobacco stem cultures.)

·         Since 1939 it was possible to culture:-

i. भ्रूण (Van Overbeck - 1941)

[Embryos (Van Overbeck - 1941)]

ii. एकल पृथक्कृत कोशिका (Muir - 1954)

[Single isolated cell (Muir - 1954)]

iii. निलम्बन संवर्धनों को स्थापित करना (Steward and Shantz - 1955)

[To establish suspension cultures (Steward and Shantz - 1955)]

·         Dawson (1942):- इन्होंने पादप ऊत्तक संवर्धन की कृत्रिम रूप से महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट्स के जैवसंश्लेषण करने की जन्मजात क्षमता को प्रदर्शित किया जो जैविक महत्व के अनेक द्वितीयक मेटाबोलाइट्स का उत्पादन करता है।

(He demonstrated the innate capacity of plant tissue cultures to biosynthesize important metabolites in vitro which led to the production of many secondary metabolites of vital importance.)

·         Miller and Skoog (1955):-

Ø  मिलर ने kinetin की खोज की।

(Miller discovered the kinetin.)

Ø  Miller व Skoog ने तम्बाकू ऊतक संवर्धनों का उपयोग करके अंग निर्माण के हार्मोन द्वारा नियंत्रण की अवधारणा का प्रदर्शन किया।

(Miller and Skoog demonstrated the concept of hormonal control of organ formation using tobacco tissue cultures.)

·         Steward (1958):- इन्होंने एक कायिक कोशिका की अंतर्निहित क्षमता, जो सम्पूर्ण पौधे में विकसित करती है, को प्रकट किया, जो कोशिकाओं की पूर्णशक्तता को साबित करती है।

(He revealed the inherent capacity of a somatic cell to regenerate into complete plant which proved the totipotency of cells.)

·         Steward and Rienert (1958):- इन्होंने गाजर के संवर्धनों में कायिक भ्रूणजनन को देखा।

(They reported somatic embryogenesis in carrot cultures.)

·         Morel (1960):- इन्होंने विभाज्योत्तक संवर्धन के द्वारा रोगजनक मुक्त ऑर्किड पौधों का उत्पादन किया और इस पद्धति का बाद में अनेक पौधों की जातियों में उपयोग किया गया।

(He produced pathogen free orchid plants through meristem culture and this method was later exploited in many plant species.)

·         Guha and Maheshwari (1964):- इन्होंने Datura inoxa के परागकण या परागकोष संवर्धन से अगुणित भ्रूण और उसके बाद पौध निर्माण को प्रेरित किया।

(He induced haploid embryos and subsequently plantlets from pollen or anther cultures of Datura inoxa.)

·         Cocking (1960):- इन्होंने टमाटर (Lycopersicum esculentum) के मूल शिखाग्रों से प्रोटोप्लास्ट के एंजाइमेटिक पृथक्करण को प्रदर्शित किया।

[He reported enzymatic isolation of protoplasts from root tips of tomato (Lycopersicum esculentum).]

·         Power (1970):- इन्होंने प्रोटोप्लास्ट संलयन का विचार दिया।

(He gave the idea of protoplast fusion.)

·         Takebe (1971):- इन्होंने तम्बाकू की पर्णमध्योत्तक कोशिकाओं से पृथक किए गए प्रोटोप्लास्ट से पौधों के निर्माण में सफलता प्राप्त की।

(He reported successful regeneration of plantlets from protoplasts isolated from tobacco mesophyll cells.)

·        1971 के बाद से अंतराजातीय व अंतरावंशीय संकरों के उत्पादन ली अनेक रिपोर्ट उपलब्ध हैं। (Bhojwani and Rajdan - 1983)

[Since 1971 many reports are available on the production of interspecific and intergeneric hyrids.(Bhojwani and Rajdan - 1983)]

·          Heinz and Mee (1969, 1971):- कायिकक्लोनीय विविधों के उनके अवलोकन ने कई शोधकर्ताओं को इस दिशा में काम करने के लिए प्रोत्साहित किया और उन्हें वांछित लक्षणों युक्त किस्में जारी करने की अनुमति दी।

(Their observation of somaclonal variants encouraged many researchers to work in this direction and allowed them to release many varieties with desired characters.)

·         Redenbaugh (1984):- उन्होंने कृत्रिम बीजों के उत्पादन की दृष्टि से कायिक भ्रूणों का कैप्सूलीकरण किया।

(He reported the encapsulation of somatic embryos with a view to produce artificial seeds.)

·         Kitto and Janick (1985) and Ow (1986):- इन्होंने सफलतापूर्वक आनुवंशिक रूपान्तरण का प्रदर्शन किया और fire fly luciferas जीन के द्वारा रूपान्तरण से पराजैनिक तंबाकू के पौधे प्राप्त किए।

(They successfully demonstrated the genetic transformation and obtained transgenic tobacco plants by transformation of fire fly luciferase gene.)

History of Micropropagation (सूक्ष्म प्रवर्धन का इतिहास):-

·         Lewis Knudson (1922):-

Ø  आर्किड में प्रथम कृत्रिम भ्रूण अंकुरण। अर्थात कृत्रिम भ्रूण संवर्धन का आविष्कार।

(1^st in vitro embryo germination in orchid. It means the invention of in vitro embryo culture.)

Ø  आर्किड बीजों का गैर-सहजीवी अंकुरण।

(Non-symbiotic germination of orchid seeds.)

·         Gavino Rotor (1949):-

Ø  प्रथम कृत्रिम कायिक प्रवर्धन।

(1^st in vitro vegetative propagation.)

Ø  Phalaenopsis जातियों और संकरों के कायिक प्रवर्धन की एक विधि।

(A method of vegetative propagation of Phalaenopsis species and hybrids.)

·         F.C. Steward (1959):- गाजर में प्रथम कायिक भ्रूणजनन।

(1^st somatic embryogenesis in carrot.)

·         F.C. Steward, MO Mapes and K Mears (1959):- संवर्धित कोशिकाओं की वृद्धि और संगठित विकास।

(Growth and organized development of cultured cells.) 

Management of micro propagated plants in laboratory and net houses:-

 Development of plants in growth room:-

> After the inoculation of the plant tissue, the bottles are sealed and transferred into growth room to trigger developmental process under diffused light (fluorescent light of 1000-2000 lux) at 25 ± 2oC and 50 to 60% relative humidity. Light and temperature requirements vary from species to species and sometimes during the various stages of developments.

> The cultures are observed daily for growth and any signs of infection / contamination. Cultures, that do not show good growth or infected, are discarded. The healthy cultures grow into small shoot buds. These are subcultured on the fresh medium after 4 weeks. 

> The number of subcultures required is specific to the plant species, which are standardized. The shoots generally develop after 4 weeks. After enough number of shoots is developed in each container (10 to 15), to a minimum height of 2 cm they are transferred to another medium for initiating the process of rooting. The constituent of rooting medium for each plant species are specific. Roots are generally formed within 2 to 4 weeks. Plants at this stage are delicate and require careful handling. 

Hardening of micro plants:- 

> Due to very high humidity inside the culture vessel and artificial conditions of development, the plantlets are tender and are therefore are not ready for coping up with the filed conditions. The plants removed from the sterile medium are washed and are maintained under intermittent mist or are covered with clean transparent plastic. 

> After 10 to 15 days under high humidity, the plants are transferred to green house and maintained for another 4 to 6 weeks. They are then ready to be transferred to net house or the field. Normally, the tissue culture plants are sold either as ex-agar plants or hardened plants from the green house. 

1. Ex-agar plants:- 

- Depending on the parameters such as location/the site of planting, soil quality and the climatic conditions defined by the customer, the ex-agar plant for sale could be in vitro rooted plants or only the shoots. When the tissue culture plants are sold at this stage, the plants are washed in sterilized water to remove the agar medium.

- The washed plants are sorted into 2 to 3 grades and packed in corrugated plastic boxes lined with sterilized tissue paper as per specifications of the Plant Quarantine Authority, Government of India for exports. The number of plants per box depends on the customer’s requirement. Depending on the final destination and the preference of the customer, the plants are treated with specific fungicides and antibiotics to avoid infection.

- The ex-agar plants are preferred for export or for destinations where hardening facility are available. The plants after being removed from nutrient media should preferably be transplanted within 72 hours.

2. Hardened plants:-

- The plants are transferred to net pots/ pro tray for acclimatization after they fully develop shoots and roots in the bottles. The rooted plantlets are transferred to pots filled with suitable substrate and are watered. This operation is carried out on an open bench. 

- These pots are then transferred to the green house for 4 to 6 weeks. During this process, they are given fertilizers and treated like plantlets obtained by any other means of propagation. 

- After the plants are acclimatized fully, they are transferred to poly-bags. At this stage the plants are completely hardened and are ready to be planted in the field for cultivation. 

- Hardening units can be set up in sites away from the micro-propagation unit.

प्रयोगशाला और नेट हाउस में सूक्ष्म प्रवर्धन द्वारा उगाए गए पौधों का प्रबंधन:-

 वृद्धि कक्ष में पौधों का विकास:-

पौधे के ऊतकों में इनोक्यूलेशन के बाद, बोतलों को सील कर दिया जाता है और विकास प्रक्रिया शुरू करने के लिए उन्हें विसरित प्रकाश (1000-2000 लक्स का फ्लोरोसेंट प्रकाश) में 25 ± 2°C तापमान और 50 से 60% सापेक्ष आर्द्रता पर वृद्धि कक्ष में स्थानांतरित कर दिया जाता है। प्रकाश और तापमान की आवश्यकताएं प्रजातियों के अनुसार और कभी-कभी विकास के विभिन्न चरणों में भिन्न होती हैं।

कल्चर की वृद्धि और संक्रमण/संदूषण के किसी भी लक्षण के लिए प्रतिदिन निगरानी की जाती है। जिन कल्चर में अच्छी वृद्धि नहीं होती या जो संक्रमित होते हैं, उन्हें हटा दिया जाता है। स्वस्थ कल्चर छोटे अंकुरों में विकसित होते हैं। इन्हें 4 सप्ताह बाद ताजे माध्यम पर उप-संवर्धन किया जाता है। 

आवश्यक उपसंवर्धनों की संख्या पौधे की प्रजाति के अनुसार अलग-अलग होती है, जिन्हें मानकीकृत किया जाता है। अंकुर आमतौर पर 4 सप्ताह बाद विकसित होते हैं। प्रत्येक गमले में पर्याप्त संख्या में अंकुर (10 से 15) कम से कम 2 सेंटीमीटर की ऊंचाई तक विकसित होने के बाद, उन्हें जड़ विकास की प्रक्रिया शुरू करने के लिए दूसरे माध्यम में स्थानांतरित कर दिया जाता है। प्रत्येक पौधे की प्रजाति के लिए जड़ विकास माध्यम के घटक विशिष्ट होते हैं। जड़ें आमतौर पर 2 से 4 सप्ताह में बन जाती हैं। इस अवस्था में पौधे नाजुक होते हैं और उन्हें सावधानीपूर्वक संभालने की आवश्यकता होती है। 

सूक्ष्म पौधों का सख्तीकरण:- 

संवर्धन पात्र के भीतर अत्यधिक आर्द्रता और कृत्रिम विकास परिस्थितियों के कारण, पौधे नाजुक होते हैं और इसलिए खेत की परिस्थितियों के अनुकूल होने के लिए तैयार नहीं होते हैं। रोगाणु रहित माध्यम से निकाले गए पौधों को धोया जाता है और उन्हें रुक-रुक कर पानी की फुहार के नीचे रखा जाता है या साफ पारदर्शी प्लास्टिक से ढक दिया जाता है। 

उच्च आर्द्रता में 10 से 15 दिनों तक रखने के बाद, पौधों को ग्रीनहाउस में स्थानांतरित कर दिया जाता है और 4 से 6 सप्ताह तक वहीं रखा जाता है। इसके बाद वे नेट हाउस या खेत में स्थानांतरित करने के लिए तैयार हो जाते हैं। आमतौर पर, ऊतक संवर्धन से प्राप्त पौधों को ग्रीनहाउस से प्राप्त एक्स-अगर पौधों या कठोर किए गए पौधों के रूप में बेचा जाता है। 

1. एक्स-अगर पौधे:- 

ग्राहक द्वारा निर्धारित स्थान/रोपण स्थल, मिट्टी की गुणवत्ता और जलवायु परिस्थितियों जैसे मापदंडों के आधार पर, बिक्री के लिए उपलब्ध एक्स-अगर पौधे इन विट्रो रूटेड पौधे या केवल शूट हो सकते हैं। इस अवस्था में टिशू कल्चर पौधों की बिक्री के दौरान, अगर माध्यम को हटाने के लिए उन्हें रोगाणुरहित पानी से धोया जाता है।

धोए गए पौधों को 2 से 3 श्रेणियों में छाँटा जाता है और निर्यात के लिए भारत सरकार के पादप संगरोध प्राधिकरण के निर्देशों के अनुसार रोगाणुरहित टिशू पेपर से ढके नालीदार प्लास्टिक के बक्सों में पैक किया जाता है। प्रति बॉक्स पौधों की संख्या ग्राहक की आवश्यकता पर निर्भर करती है। अंतिम गंतव्य और ग्राहक की पसंद के आधार पर, संक्रमण से बचाव के लिए पौधों को विशिष्ट फफूंदनाशकों और एंटीबायोटिक दवाओं से उपचारित किया जाता है।

- निर्यात के लिए या उन स्थानों के लिए जहां पौधों को मजबूत बनाने की सुविधा उपलब्ध है, एक्स-अगर पौधों को प्राथमिकता दी जाती है। पोषक माध्यम से निकालने के बाद पौधों को अधिमानतः 72 घंटों के भीतर रोपित कर देना चाहिए।

2. कठोरीकृत पौधे:-

- जब पौधे बोतलों में पूरी तरह से अंकुर और जड़ें विकसित कर लेते हैं, तो उन्हें अनुकूलन हेतु जालीदार गमलों/प्रो ट्रे में स्थानांतरित कर दिया जाता है। जड़युक्त पौधों को उपयुक्त मिट्टी से भरे गमलों में स्थानांतरित करके पानी दिया जाता है। यह प्रक्रिया खुली सतह पर की जाती है। 

- इसके बाद इन गमलों को 4 से 6 सप्ताह के लिए ग्रीनहाउस में स्थानांतरित कर दिया जाता है। इस प्रक्रिया के दौरान, उन्हें उर्वरक दिए जाते हैं और अन्य तरीकों से उगाए गए पौधों की तरह ही उनकी देखभाल की जाती है। 

पौधों के पूरी तरह से अनुकूलित हो जाने के बाद, उन्हें पॉली-बैग में स्थानांतरित कर दिया जाता है। इस अवस्था में पौधे पूरी तरह से कठोर हो जाते हैं और खेती के लिए खेत में रोपने के लिए तैयार हो जाते हैं। 

- माइक्रो-प्रोपेगेशन यूनिट से दूर स्थानों पर हार्डनिंग यूनिट स्थापित की जा सकती हैं।