2019 Solved Old Paper (BOT - 304D) New OK
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> The desired gene sequence can be inserted into these vectors and then put back into yeast; the yeast machinery cannot differentiate between their own and foreign genes; hence the foreign gene is also replicated.
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> वांछित जीन अनुक्रम को इन वैक्टरों में डाला जा सकता है और फिर वापस यीस्ट में डाल दिया जाता है; यीस्ट की कार्यप्रणाली अपने और बाहरी जीनों में अंतर नहीं कर पाती; इसलिए बाहरी जीन की भी प्रतिकृति हो जाती है।
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Direct Gene Transfer:- When stable transformation is achieved by incorporating the desired gene into the genome of plant cells without the help of any biological factor, it is called direct gene transfer.
1. Gene gun method:-
> It is a physical method of gene transfer.
> It is also called Biolistic method.
> In this, tungsten or gold particles of 1-2µm diameter are coated with DNA and fired them into the cell by a particle gun.
> Gold is expensive, but it is less harmful to cells.
> The cost of a particle gun is almost 15 lakhs.
> The particles are accelerated by compressed helium gas in the particle gun.
> DNA reaches inside the nucleus and becomes incorporated into the plant's genome.
> By this method, the gene is transferred to the meristem and embryo.
2. PEG mediated Gene Transfer:-
> It is a chemical method of gene transfer.
> In this method gene transfer is induced by PEG. (PEG = Poly Ethylene Glycol)
> Transformation medium is added in a beaker that has a high concentration of Mg2 + ions.
> Now plant protoplasts are put into this nutritive medium.
> Now put the desired gene in the beaker.
> Now take the pH to 8.
> Now add 20% PEG.
> Now decrease the concentration of PEG and increase the concentration of Ca2+ ions.
> Now incubate for some time.
> The transformation frequency increases 10 to 1000 times when plant protoplasts are transferred to ice after heat-shock at 45°C for 5 minutes just before adding DNA.
3. Electroporation:- Introduction of DNA into plant cells by making minute pores in the plant cell membrane is called as electroporation.
> This method involves suspension of plant protoplasts in a suitable ionic solution containing linearized recombinant plasmid DNA.
> This mixture is then exposed to low voltage-long pulses or high voltage short pulses for the desired number of cycles.
> The electrical pulses are thought to induce transient pores in the plasma lemma through which the DNA molecules are incorporated.
> Treated protoplasts are then cultured to obtain cell colonies and plants.
4. Microinjection:-
> It involving the mechanical insertion of the desirable DNA into a target cell.
> The target cell may be the one identified from intact cells, protoplasts, callus, embryos, meristems, etc.
> Microinjection is used for the transfer of cellular organelles and for the manipulation of chromosomes. > The technique of microinjection involves the transfer of the gene through a micropipette (0.5-10.0 pm tip) into the cytoplasm/nucleus of a plant cell or protoplast.
> While the gene transfer is done, the recipient cells are kept immobilized in agarose embedding, and held by a suction holding pipette. > As the process of microinjection is complete, the transformed cell is cultured and grown to develop into a transgenic plant.
> In fact, transgenic tobacco and Brassica napus have been developed by this approach.
> The major limitations of microinjection are that it is slow, expensive, and has to be performed by trained and skilled personnel.
1. जीन गन विधि :-
यह जीन स्थानांतरण की एक भौतिक विधि है।
इसे बायोलिस्टिक विधि भी कहा जाता है।
इसमें , 1-2 माइक्रोमीटर व्यास वाले टंगस्टन या सोने के कणों को डीएनए से लेपित किया जाता है और एक पार्टिकल गन द्वारा उन्हें कोशिका में दागा जाता है ।
सोना महंगा है, लेकिन यह कोशिकाओं के लिए कम हानिकारक है।
पार्टिकल गन की कीमत लगभग 15 लाख रुपये है ।
पार्टिकल गन में संपीड़ित हीलियम गैस द्वारा कणों को त्वरित किया जाता है ।
डीएनए केंद्रक के अंदर पहुँच जाता है और पौधे के जीनोम में शामिल हो जाता है।
इस विधि द्वारा जीन को मेरिस्टेम और भ्रूण में स्थानांतरित किया जाता है ।
2. पीईजी मध्यस्थता द्वारा जीन स्थानांतरण:-
यह जीन स्थानांतरण की एक रासायनिक विधि है।
इस विधि में जीन स्थानांतरण को पीईजी ( PEG = पॉली एथिलीन ग्लाइकॉल) द्वारा प्रेरित किया जाता है ।
> एक बीकर में, जिसमें Mg2+ आयनों की उच्च सांद्रता होती है, रूपांतरण माध्यम मिलाया जाता है।
अब पादप प्रोटोप्लास्ट को इस पोषक माध्यम में रखा जाता है।
अब वांछित जीन को बीकर में डालें।
अब pH को 8 तक ले जाएं।
अब इसमें 20% पीईजी मिलाएं।
अब PEG की सांद्रता घटाएं और Ca2+ आयनों की सांद्रता बढ़ाएं।
अब इसे कुछ समय के लिए निष्क्रिय अवस्था में रखें।
जब पादप प्रोटोप्लास्ट को डीएनए डालने से ठीक पहले 5 मिनट के लिए 45°C पर हीट-शॉक देने के बाद बर्फ में स्थानांतरित किया जाता है, तो रूपांतरण आवृत्ति 10 से 1000 गुना तक बढ़ जाती है ।
3. इलेक्ट्रोपोरेशन:- पादप कोशिका झिल्ली में सूक्ष्म छिद्र बनाकर पादप कोशिकाओं में डीएनए का प्रवेश कराना इलेक्ट्रोपोरेशनकहलाता है
इस विधि में पादप प्रोटोप्लास्ट को रेखीयकृत युक्त उपयुक्त आयनिक विलयन में निलंबित करना शामिल है। पुनर्संयोजित प्लास्मिड डीएनए।
इसके बाद इस मिश्रण को वांछित संख्या में चक्रों के लिए कम वोल्टेज वाले लंबे पल्स या उच्च वोल्टेज वाले छोटे पल्स के संपर्क में लाया जाता है।
ऐसा माना जाता है कि विद्युत स्पंदन प्लाज्मा लेम्मा में क्षणिक छिद्र उत्पन्न करते हैं, जिनके माध्यम से डीएनए अणु समाहित हो जाते हैं।
उपचारित प्रोटोप्लास्ट को फिर संवर्धित करके कोशिका कॉलोनियां और पौधे प्राप्त किए जाते हैं।
4. माइक्रोइंजेक्शन:-
इसमें वांछित डीएनए को लक्षित कोशिका में यांत्रिक रूप से सम्मिलित करना शामिल है।
लक्षित कोशिका वह हो सकती है जिसे अक्षुण्ण कोशिकाओं, प्रोटोप्लास्ट, कैलस, भ्रूण, मेरिस्टेम आदि से पहचाना गया हो।
माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग कोशिकीय अंगों के स्थानांतरण और गुणसूत्रों के हेरफेर के लिए किया जाता है। माइक्रोइंजेक्शन की तकनीक में माइक्रोपिपेट (0.5-10.0 pm) के माध्यम से जीन का स्थानांतरण शामिल है। किसी पादप कोशिका या प्रोटोप्लास्ट के कोशिका द्रव्य/नाभिक में (नोक के सिरे से)।
जीन स्थानांतरण के दौरान, प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को एगारोज एम्बेडिंग में स्थिर रखा जाता है, और एक सक्शन होल्डिंग पिपेट द्वारा पकड़कर रखा जाता है। माइक्रोइंजेक्शन की प्रक्रिया पूरी होने के बाद, रूपांतरित कोशिका को संवर्धित किया जाता है और विकसित होने तक बढ़ाया जाता है। एक ट्रांसजेनिक पौधे में।
दरअसल, इसी पद्धति से ट्रांसजेनिक तंबाकू और ब्रासिका नैपस विकसित किए गए हैं।
माइक्रोइंजेक्शन की प्रमुख सीमाएं यह हैं कि यह धीमी, महंगी है और इसे प्रशिक्षित और कुशल कर्मियों द्वारा ही किया जाना चाहिए।
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Indirect Gene Transfer:- When stable transformation is achieved by incorporating genes into the genome of plant cells with the help of a biological factor, it is called indirect gene transfer. Agrobacterium bacterium is used in this.
Agrobacterium mediated Gene Transfer:-
• Agrobacterium is a gram -ve bacterium found in soil around plant roots.
• Two species of Agrobacterium bacteria cause diseases in dicot plants:-
i. Agrobacterium tumefaciens
ii. Agrobacterium rhizogenes
i. Agrobacterium tumefaciens:- It causes Crown gall disease in angiosperm plants. Ti-plasmid is found in it.
ii. Agrobacterium rhizogenes:- It cause hairy root disease in angiosperm plants. Ri - plasmid is found in it.
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• Recombinant DNA is made by incorporating the desired gene into the T - DNA portion of the Ti plasmid. Which are transferred to Agrobacterium cell.
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• Now cut round pieces of sterilized leaf.
• Now incubate these pieces with Agrobacterium overnight.
• Now kept these pieces in Shooting medium for 2 days.
• Now add Kanamycin and Carbenicillin in this shooting medium and cultured for 3-4 weeks.
• Now transfer this to the rooting medium, add Kanamycin and Carbenicilin, culture it for 3-4 weeks.
• Now establish this plant in a pot in green house.
• After a few days, establish the plant in the soil of the field.
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Mechanism of Gene Transfer:-
• The T - DNA portion of the Ti - plasmid has the property that it can integrate into the plant's genome.
• Leaf pieces release the Aceto - Syringine chemical that activates the Vir - Operon of T - DNA.
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• Once activated, the T-DNA portion separates from the plasmid and enters into many plant cells.
• Now this T-DNA integrates into the genome by going into the nucleus.
• This results in stable transformation of the plant.
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एग्रोबैक्टीरियम द्वारा मध्यस्थता से जीन स्थानांतरण:-
• एग्रोबैक्टीरियम एक ग्राम-ऋणात्मक जीवाणु है जो पौधों की जड़ों के आसपास की मिट्टी में पाया जाता है।
• एग्रोबैक्टीरियम बैक्टीरिया की दो प्रजातियाँ द्विबीजपत्री पौधों में रोग उत्पन्न करती हैं:-
i. एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियंस
ii. एग्रोबैक्टीरियम राइजोजेन्स
i. एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियंस :- यह एंजियोस्पर्म पौधों में क्राउन गॉल रोग का कारण बनता है। इसमें टीआई-प्लास्मिड पाया जाता है।
ii. एग्रोबैक्टीरियम राइजोजेन्स :- यह एंजियोस्पर्म पौधों में रोएंदार जड़ रोग का कारण बनता है। इसमें Ri-प्लाज्मिड पाया जाता है।
• वांछित जीन को Ti प्लास्मिड के T-DNA भाग में शामिल करके पुनर्संयोजित DNA बनाया जाता है। इन्हें एग्रोबैक्टीरियम कोशिका में स्थानांतरित किया जाता है।
• अब रोगाणुरहित पत्तों के गोल टुकड़े काट लें।
• अब इन टुकड़ों को एग्रोबैक्टीरियम के साथ रात भर इनक्यूबेट करें।
• अब इन टुकड़ों को दो दिनों के लिए शूटिंग मीडियम में रखा गया।
• अब इस शूटिंग मीडियम में कैनामाइसिन और कार्बेनिकिलिन मिलाएं और 3-4 सप्ताह तक कल्चर करें।
• अब इसे रूटिंग मीडियम में स्थानांतरित करें, इसमें कैनामाइसिन और कार्बेनिसिलिन मिलाएं और इसे 3-4 सप्ताह तक कल्चर करें।
• अब इस पौधे को ग्रीनहाउस में एक गमले में लगा दें।
• कुछ दिनों बाद, पौधे को खेत की मिट्टी में लगा दें।
जीन स्थानांतरण की प्रक्रिया:-
• टीआई-प्लास्मिड के टी-डीएनए भाग में यह गुण होता है कि यह पौधे के जीनोम में एकीकृत हो सकता है।
• पत्ती के टुकड़े एसिटो-सिरिंगिन नामक रसायन छोड़ते हैं जो टी-डीएनए के विर-ऑपेरॉन को सक्रिय करता है।
• सक्रिय होने के बाद, टी-डीएनए भाग प्लास्मिड से अलग हो जाता है और कई पादप कोशिकाओं में प्रवेश कर जाता है।
• अब यह टी-डीएनए केंद्रक में जाकर जीनोम में एकीकृत हो जाता है।
• इसके परिणामस्वरूप पौधे का स्थिर रूपांतरण होता है।
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