2018 Solved Old Paper (BOT - 304D) New OK

Cloning vector:- It is a small piece of DNA that can be stably maintained in an organism, and into which a foreign DNA fragment can be inserted for cloning purposes.

Properties of good vector:-

- Capable of replicating inside the host.

- Have compatible restriction site for insertion of DNA molecule (insert).

- Capable of autonomous replication inside the host (ori site).

- Smaller in size and able to incorporate larger insert size.

- Have a selectable marker for screening of recombinant organism.

Properties of good host:-

- Be easy to transform.

- Support the replication of recombinant DNA.

- Be free from elements that interfere with replication of recombinant DNA.

- Lack active restriction enzymes, e.g., E.coli K12 substrain HB 101.

- Should not have methylases, since, these enzymes would methylate the replicated recombinant DNA

which, as a result, would become resistant to useful restriction enzymes.

- Be deficient in normal recombinant function, so, that, the DNA insert is not altered by recombination

events.

3 main types are -

1. Plasmids

2. Cosmids

3. Phages

1. Plasmids:-

> In 1952, the term plasmid was introduced by Joshua Lederberg, the American molecular biologist to refer to “any extrachromosomal hereditary determinant”.

> A plasmid is a small, extrachromosomal DNA molecule within a cell that is physically separated from chromosomal DNA and can replicate independently.

Characteristics of ideal plasmid vectors:-

i. Size:- Plasmid must be small in size. The small is helpful for easy uptake of cDNA by host cells and for the isolation of plasmid without damage. Ideal vector should be less than or equal to 10kb. The small size is essential for easy introduction in cell by transformation, transduction and electroporation.

ii. Copy number:- The plasmid must be present in multiple copies.

iii. Genetic markers:- Plasmid must have one or few genetic markers. These markers help us for the selection of organism that has recombinant DNA

iv. Origin of replication:- The plasmid must have its own orogin of replication and regulatory genes for the self-replication.

v. Unique restriction sites:- The plasmid must have unique restriction sites common restriction enzymes in use.

vi. Multiple cloning sites:- This property permits the insertion of gene of interest and plasmid recircularization.

vii. Insertional inactivation:- The plasmid must have unique sites for restriction enzymes in marker genes. This will help us for the selection of recombination by insertional inactivation method.

viii. Pathogenicity:- The plasmid should not have any pathogenic property.

ix. Should not be transferred by conjugation:- This property of vector molecule prevents recombinant DNA to escape to natural population of bacteria.

x. Selectable make gene:- Vector molecules should have some detectable traits. These traits enable the

transformed cells to be identified among the non-transformed ones. eg. antibiotic resistance gene.

Examples:-

a. pBR322:-

- pBR322 is a widely-used E. coli cloning vector. 

- It was created in 1977 in the laboratory of Herbert Boyer at the University of California San Francisco. 

- The p stands for "plasmid" and BR for "Bolivar" and "Rodriguez", researchers who constructed it.

- pBR322 is 4363 base pairs in length.

- pBR322 plasmid has the following elements:-

i. “rep” replicon from plasmid pMB1 which is responsible for replication of the plasmid.

ii. “rop” gene encoding Rop protein, are associated with stability of plasmid and also controls copy number (increase number). The source of “rop” gene is pMB1plasmid.

iii. “tet” gene encoding tetracycline resistance derived from pSC101 plasmid.

iv. “bla” gene encoding β lactamase which provide ampicillin resistance (source: transposon Tn3).

- It carries two sets of antibiotic resistance genes. Either ampicillin or tetracycline resistance can be used as a selectable marker for cells containing the plasmid.

- It has a reasonably high copy number. Generally, there are about 15 molecules present in a transformed E. coli cell, but this number can be increased up to between 1000 and 3000 by plasmid amplification in the presence of a protein synthesis inhibitor such as chloramphenicol. 

- It has 528 restriction sites for 66 restriction enzymes. Among them 20 restriction enzymes cut it at

unique restriction sites. Tetracycline has 6 unique sites for 6 restriction enzymes. Ampicillin gene has 3

unique restriction site.

b. pUC plasmids:-

- pUC plasmids are small, high copy number plasmids of size 2686bp.

- This series of cloning vectors were developed by Messing and co-workers in the University of California. 

- The p in its name stands for plasmid and UC represents the University of California.

- pUC vectors contain a lacZ sequence and multiple cloning site (MCS) within lacZ. This helps in use of broad spectrum of restriction endonucleases and permits rapid visual detection of an insert.

- pUC18 and pUC19 vectors are identical apart from the fact that the MCS is arranged in opposite orientation.

- pUC vectors consists of following elements:

i. “rep” replicon region derived from plasmid pBR322 with single point mutation (to increase copy

number).

ii. “bla” gene encoding β lactamase which provide ampicillin resistance which is derived from pBR322. This site is different from pBR322 by two point mutations.

iii. E.coli lac operon system.

-  “rop” gene is removed from this vector which leads to an increase in copy number.

2. Cosmids:-

> It is first described by Collins and Hohn in 1978.

> It is formed by joining ends of a linearized plasmid DNA with cos-site of lambda DNA.

> It is the commonly used cloning vector suitable for cloning large DNA fragments upto 45 kbp.

> Cosmid has an origin of replication, selectable markers, and gene cloning sites of plasmid DNA.

Salient features:-

i. Cosmid is a circular ds DNA.

ii. It has two complementary single-stranded regions at both ends of a plasmid DNA. The two cos-ends form a duplex by base pairing.

iii. The cosmid DNA does not code for phage proteins and host cell lysis.

iv. It does not involve in multiplication of phage particles.

v. It has an origin of replication from plasmid DNA for independent replication.

vi. It has selectable marker genes and gene cloning sites of plasmid DNA

vii. The cosmid DNA is packed within protein coat of bacteriophage to form inactive phage particles. Cos-site is a prerequsites for invitro packaging of cosmid in phage protein coat.

viii. After infection, the cosmid DNA does not integrate into host chromosomal DNA. It exits as a definite extra chromosomal DNA and replicates independently.

Examples:-

i. Cosmid pLFR5:- 

- It is 6 kbp in size.

- It is constructed from E.coli plasmid pBR322 and two cos-ends of lambda DNA.

ii. Cosmid pJB8:-

- It is 5.4 kbp in size. 

- It is constructed from the plasmid pBR322 and cos sites of lambda DNA.

iii. Cosmid pHC79:-

- It is 6.5 kbp in size.

- It is constructed from pBR322 and cos-sites of lambda DNA.

Advantages:-

- Cosmid pick up relatively larger DNA fragments than the plasmid do.

- As cosmids pick up large DNA fragments, they are used to establish gene libraries

- Gene cloning through cosmids helps in the study of non-sence sequences in the genome of organisms.

- Some cosmids are constructed by joining a linearized plasmid DNA with DNA fragments of p1

bacteriophage that have cos-ends. The P1 bacteriophage has the genome of 115 kbp. So, a DNA of 85

kbp can be packaged into the head of P1 phage. These cosmids help to clone large genes and gene

clusters in bacteria.

Disadvantages:-

- The packaging enzyme fails to pack recombinant cosmids into the phage head, if any one of the two

cos-ends is missing.

- Sometimes more than one recombinant cosmid join together to form a large DNA. If so, the packaging

enzyme fails to pack the DNA into the phage head.

- Slower replication

- Higher frequency of recombination inside bacterial host.

- Unstable inside E.coli host and thus easy to lose vector. 

3. Phages:- 

Bacteriophage:-

> Virus that infect bacteria is known as bacteriophage. 

> It was discovered by Frederick.W.Twort in Great Britian (1915) and Felix d’ Herelle in France(1917). > D’ Herelle coined the term bacteriophage meaning ‘bacterial eater’ to describe the agent’s bacteriocidal activity.

> Phages are very simple in structure, consisting merely of a DNA (or occasionally ribonucleic acid (RNA)) molecule carrying a number of genes,surrounded by a protective coat or capsid made up of protein molecules. 

> They can undergo two life cycle:-

i. Lytic cycle 

ii. Lysogenic cycle

Bacteriophage as a vector:-

> It can accept very large pieces of foreign DNA. 

> Genetic engineers have constructed numerous derivatives of phage vectors that contain only one or two sites for a variety of restriction enzymes. 

> Phage that have a stuffer fragment are called substitution vectors because they are designed to have a piece removed and substituted with something else. 

> Examples:- Lambda phage, M13 phage, T4,T7 phage, P1 phage etc.

a. M13 PHAGE:- 

- Bacteriophage M13 was first isolated from wastewater in Munich (Hofschneider, 1963). Hence named as M13 phage. 

- It is a filamentous phage which has 6407 nucleotides. 

- It possess single stranded circular DNA. 

- It was sequenced by Sanger in 1982.

- Genome of M13 phage:

Construction of M13 as phage vector:-

i. The first step in construction of an M13 cloning vector was to introduce the lacZ′ gene into the intergenic sequence. 

ii. This gave rise to M13mp1, which forms blue plaques on X-gal agar. 

iii. M13mp1 does not possess any unique restriction sites in the lacZ′ gene. 

iv. M13mp2 vector:- It contains the hexanucleotide GGATTC near the start of the gene. A single nucleotide change would make this GAATTC, which is an EcoRI site. This alteration was carried out using in vitro mutagenesis, resulting in M13mp2. 

v. M13mp7 vector:- A polylinker, which consists of a series of restriction sites and has EcoRI sticky ends. This polylinker was inserted into the EcoRI site of M13mp2, to give M13mp7 a more complex vector with four possible cloning sites (EcoRI, BamHI, SalI, and PstI). The polylinker is designed so that it does not totally disrupt the lacZ′ gene. Although it is altered, b-galactosidase enzyme is still produced.

b. P1 PHAGE:-

 - P1 is a temperate bacteriophage (phage) that infects Escherichia coli and a some other bacteria. 

 - When undergoing a lysogenic cycle the phage genome exists as a plasmid in the bacterium. 

- Unlike other phages it integrate into the host DNA. 

 - P1 has an icosahedral "head" containing the DNA attached to a contractile tail with six tail fibers.

- The genome of the P1 phage is moderately large, around 93Kbp in length. Once inserted into the host it circularizes and replicates as a plasmid. 

- The genome contains two origins of replication, oriR which replicates it during the lysogenic cycle and oriL which replicates it during the lytic stage.

- The development of a bacteriophage P1 cloning system capable of accepting DNA fragments as large as 100 kilobase pairs (kbp). 

- Phage particles has two P1 loxP recombination sites to cyclize the packaged DNA once it has been injected into a strain of Escherichia coli containing the P1 Cre recombinase, a kanamycin resistant gene to select bacterial clones containing the cyclized DNA. 

- P1 plasmid replicon to stably maintain that DNA in E. coli at one copy per cell chromosome, and a lac promoter-regulated P1 lytic replicon to amplify the DNA before it is reisolated.

क्लोनिंग वेक्टर:-  यह डीएनए का एक छोटा सा टुकड़ा होता है जिसे किसी जीव में स्थिर रूप से बनाए रखा जा सकता है, और जिसमें क्लोनिंग के उद्देश्य से डीएनए का एक बाहरी खंड डाला जा सकता है।

अच्छे वेक्टर के गुणधर्म:-

- होस्ट के अंदर प्रतिकृति बनाने में सक्षम।

- डीएनए अणु (इंसर्ट) के सम्मिलन के लिए संगत प्रतिबंध स्थल मौजूद होना चाहिए।

- होस्ट (ओआरआई साइट) के अंदर स्वायत्त प्रतिकृति करने में सक्षम।

- आकार में छोटा और बड़े आकार के इंसर्ट को समायोजित करने में सक्षम।

- पुनर्संयोजित जीव की स्क्रीनिंग के लिए एक चयन योग्य मार्कर होना चाहिए।

अच्छे मेज़बान के गुण:-

- इसे आसानी से रूपांतरित किया जा सके।

- पुनर्योजित डीएनए के प्रतिकृति का समर्थन करें।

- इसमें ऐसे तत्व नहीं होने चाहिए जो पुनर्संयोजित डीएनए के प्रतिकृति में बाधा डालते हों।

- सक्रिय प्रतिबंध एंजाइमों की कमी, उदाहरण के लिए, ई. कोलाई K12 सबस्ट्रेन HB 101।

- इसमें मिथाइलेज़ एंजाइम नहीं होने चाहिए, क्योंकि ये एंजाइम प्रतिकृति किए गए रिकॉम्बिनेंट डीएनए का मिथाइलेशन कर देंगे।

जिसके परिणामस्वरूप, यह उपयोगी प्रतिबंध एंजाइमों के प्रति प्रतिरोधी हो जाएगा।

- सामान्य पुनर्संयोजित कार्य में कमी हो, ताकि डीएनए सम्मिलित भाग पुनर्संयोजन द्वारा परिवर्तित न हो।

घटनाएँ।

इसके 3 मुख्य प्रकार हैं -

1. प्लास्मिड

2. कॉस्मिड

3. फ़ेज

1. प्लास्मिड:-

1952  में, अमेरिकी आणविक जीवविज्ञानी जोशुआ लेडरबर्ग द्वारा "किसी भी बाह्य गुणसूत्रीय आनुवंशिक निर्धारक" को संदर्भित करने के लिए प्लास्मिड शब्द का प्रयोग किया गया था।

प्लास्मिड कोशिका के भीतर स्थित एक छोटा, बाह्य गुणसूत्रीय डीएनए अणु होता है जो गुणसूत्रीय डीएनए से भौतिक रूप से अलग होता है और स्वतंत्र रूप से प्रतिकृति कर सकता है।

आदर्श प्लास्मिड वेक्टर की विशेषताएं:-

i. आकार:-  प्लास्मिड का आकार छोटा होना चाहिए। छोटा आकार मेजबान कोशिकाओं द्वारा सीडीएनए के आसान अवशोषण और प्लास्मिड को बिना क्षति पहुंचाए अलग करने में सहायक होता है। आदर्श वेक्टर 10 किलोबाइट या उससे कम का होना चाहिए। कोशिकाओं में रूपांतरण, स्थानांतरण और इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा आसानी से प्रवेश के लिए छोटा आकार आवश्यक है।

ii. प्रतियों की संख्या:-  प्लास्मिड कई प्रतियों में मौजूद होना चाहिए।

iii. आनुवंशिक चिह्न:-  प्लास्मिड में एक या कुछ आनुवंशिक चिह्न होने चाहिए। ये चिह्न हमें पुनर्संयोजित डीएनए वाले जीव के चयन में सहायता करते हैं।

iv. प्रतिकृति का उद्गम:-  प्लास्मिड में स्वयं की प्रतिकृति का उद्गम और स्व-प्रतिकृति के लिए विनियामक जीन होने चाहिए।

v. विशिष्ट प्रतिबंध स्थल:-  प्लास्मिड में विशिष्ट प्रतिबंध स्थल होने चाहिए जो सामान्य रूप से उपयोग में आने वाले प्रतिबंध एंजाइमों से संबंधित हों।

vi. एकाधिक क्लोनिंग स्थल:-  यह गुण रुचि के जीन के सम्मिलन और प्लास्मिड के पुनर्चक्रण की अनुमति देता है।

vii. सम्मिलन द्वारा निष्क्रियकरण:-  मार्कर जीनों में प्रतिबंध एंजाइमों के लिए प्लास्मिड में विशिष्ट स्थल होने चाहिए। इससे हमें सम्मिलन द्वारा निष्क्रियकरण विधि द्वारा पुनर्संयोजन के चयन में सहायता मिलेगी।

viii. रोगजनकता:-  प्लास्मिड में कोई रोगजनक गुण नहीं होना चाहिए।

ix. संयुग्मन द्वारा स्थानांतरित नहीं किया जाना चाहिए:-  वेक्टर अणु का यह गुण पुनर्संयोजित डीएनए को बैक्टीरिया की प्राकृतिक आबादी में फैलने से रोकता है।

x. चयन योग्य जीन:-  वेक्टर अणुओं में कुछ पहचानने योग्य लक्षण होने चाहिए। ये लक्षण सक्षम बनाते हैं

रूपांतरित कोशिकाओं को अपरिवर्तित कोशिकाओं से अलग पहचानना। उदाहरण के लिए, एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन।

उदाहरण:-

ए. पीबीआर322:-

- pBR322 एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला ई. कोलाई क्लोनिंग वेक्टर है। 

- इसका निर्माण 1977 में कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन फ्रांसिस्को में हर्बर्ट बोयर की प्रयोगशाला में हुआ था। 

- यहाँ p का अर्थ "प्लास्मिड" है और BR का अर्थ "बोलिवर" और "रोड्रिगेज" है, जो इसे बनाने वाले शोधकर्ता हैं।

- pBR322 की लंबाई 4363 बेस पेयर है।

-  pBR322 प्लास्मिड में निम्नलिखित तत्व हैं:-

i. प्लास्मिड pMB1 से प्राप्त "rep" रेप्लिकॉन जो प्लास्मिड के प्रतिकृति के लिए जिम्मेदार है।

ii. "rop" जीन, जो Rop प्रोटीन को एनकोड करता है, प्लास्मिड की स्थिरता से संबंधित है और प्रतिलिपि संख्या (वृद्धि संख्या) को भी नियंत्रित करता है। "rop" जीन का स्रोत pMB1 प्लास्मिड है।

iii. pSC101 प्लास्मिड से प्राप्त टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोध को एन्कोड करने वाला "tet" जीन।

iv. “bla” जीन जो β लैक्टामेज़ को एनकोड करता है और एम्पीसिलीन प्रतिरोध प्रदान करता है (स्रोत: ट्रांसपोज़ोन Tn3)।

इसमें एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के दो सेट होते हैं। एम्पीसिलीन या टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोध को प्लास्मिड युक्त कोशिकाओं के लिए चयनात्मक मार्कर के रूप में उपयोग किया जा सकता है।

- इसकी प्रतिलिपि संख्या काफी अधिक होती है। सामान्यतः, एक रूपांतरित ई. कोलाई कोशिका में लगभग 15 अणु मौजूद होते हैं, लेकिन क्लोरम्फेनिकोल जैसे प्रोटीन संश्लेषण अवरोधक की उपस्थिति में प्लास्मिड प्रवर्धन द्वारा इस संख्या को 1000 से 3000 तक बढ़ाया जा सकता है। 

इसमें 66 रिस्ट्रिक्शन एंजाइमों के लिए 528 रिस्ट्रिक्शन साइट हैं। इनमें से 20 रिस्ट्रिक्शन एंजाइम इसे काटते हैं।

टेट्रासाइक्लिन में 6 विशिष्ट प्रतिबंध स्थल होते हैं, जिनमें से प्रत्येक में 6 प्रतिबंध एंजाइम होते हैं। एम्पीसिलिन जीन में 3 विशिष्ट प्रतिबंध स्थल होते हैं।

अद्वितीय प्रतिबंध स्थल।

बी. पीयूसी प्लास्मिड:-

- pUC प्लास्मिड छोटे, उच्च प्रतिलिपि संख्या वाले प्लास्मिड होते हैं जिनका आकार 2686bp होता है।

- क्लोनिंग वैक्टर की यह श्रृंखला कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में मेसिंग और उनके सहकर्मियों द्वारा विकसित की गई थी। 

इसके नाम में 'p' का अर्थ प्लास्मिड है और 'UC' कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय को दर्शाता है।

- pUC वैक्टर में lacZ अनुक्रम और lacZ के भीतर एक मल्टीपल क्लोनिंग साइट (MCS) होती है। इससे विभिन्न प्रकार के प्रतिबंध एंडोन्यूक्लियेस का उपयोग संभव होता है और इंसर्ट का तेजी से दृश्य पता लगाया जा सकता है।

- pUC18 और pUC19 वेक्टर एक जैसे हैं, सिवाय इसके कि MCS विपरीत दिशा में व्यवस्थित है।

-  pUC वैक्टर में निम्नलिखित तत्व शामिल हैं:

i. प्लास्मिड pBR322 से प्राप्त "rep" प्रतिकृति क्षेत्र जिसमें एकल बिंदु उत्परिवर्तन है (प्रतियों की संख्या बढ़ाने के लिए)।

संख्या)।

ii. "ब्ला" जीन, जो β लैक्टामेज़ को एनकोड करता है और एम्पीसिलीन प्रतिरोध प्रदान करता है, pBR322 से प्राप्त होता है। यह साइट pBR322 से दो बिंदु उत्परिवर्तनों द्वारा भिन्न है।

iii. ई. कोलाई लैक ऑपेरॉन प्रणाली।

- इस वेक्टर से "rop" जीन को हटा दिया जाता है, जिससे कॉपी संख्या में वृद्धि होती है।

2. कॉस्मिड:-

इसका सर्वप्रथम वर्णन कोलिन्स और होन ने 1978 में किया था।

इसका निर्माण रेखीयकृत प्लास्मिड डीएनए के सिरों को लैम्डा डीएनए के कोस-साइट से जोड़कर किया जाता है।

यह आमतौर पर इस्तेमाल होने वाला क्लोनिंग वेक्टर है जो 45 केबीपी तक के बड़े डीएनए खंडों की क्लोनिंग के लिए उपयुक्त है।

कॉस्मिड में प्रतिकृति का उद्गम स्थल, चयन योग्य मार्कर और प्लास्मिड डीएनए के जीन क्लोनिंग स्थल होते हैं।

प्रमुख विशेषताएं:-

i. कॉस्मिड एक वृत्ताकार डीएस डीएनए है।

ii. इसमें प्लास्मिड डीएनए के दोनों सिरों पर दो पूरक एकल-अण्डाकार क्षेत्र होते हैं। दोनों सह-छोर क्षार युग्मन द्वारा एक द्विभुज बनाते हैं।

iii. कॉस्मिड डीएनए, फ़ेज प्रोटीन और मेजबान कोशिका के विघटन के लिए कोड नहीं करता है।

iv. इसमें फ़ेज कणों का गुणन शामिल नहीं होता है।

v. इसमें स्वतंत्र प्रतिकृति के लिए प्लास्मिड डीएनए से प्रतिकृति का उद्गम होता है।

vi. इसमें चयन योग्य मार्कर जीन और प्लास्मिड डीएनए के जीन क्लोनिंग स्थल होते हैं।

vii. कॉस्मिड डीएनए को जीवाणुभेज के प्रोटीन आवरण के भीतर पैक करके निष्क्रिय फ़ेज कण बनाए जाते हैं। कॉस्मिड को फ़ेज प्रोटीन आवरण में इन विट्रो पैकेजिंग के लिए कॉस-साइट एक पूर्वापेक्षा है।

viii. संक्रमण के बाद, कॉस्मिड डीएनए मेजबान गुणसूत्र डीएनए में एकीकृत नहीं होता है। यह एक निश्चित अतिरिक्त गुणसूत्र डीएनए के रूप में मौजूद रहता है और स्वतंत्र रूप से प्रतिकृति करता है।

उदाहरण:-

i. कॉस्मिड pLFR5:- 

इसका आकार 6 केबीपी है।

- इसका निर्माण ई.कोलाई प्लास्मिड pBR322 और लैम्डा डीएनए के दो कॉस-छोरों से किया गया है।

ii. कॉस्मिड pJB8:-

इसका आकार 5.4 केबीपी है। 

- इसका निर्माण प्लास्मिड pBR322 और लैम्डा डीएनए के cos साइट्स से किया गया है।

iii. कॉस्मिड pHC79:-

इसका आकार 6.5 केबीपी है।

- इसका निर्माण pBR322 और लैम्डा डीएनए के cos-साइटों से किया गया है।

लाभ:-

कॉस्मिड, प्लास्मिड की तुलना में अपेक्षाकृत बड़े डीएनए खंडों को ग्रहण करते हैं।

कॉस्मिड द्वारा डीएनए के बड़े खंडों को ग्रहण करने के कारण, इनका उपयोग जीन लाइब्रेरी स्थापित करने के लिए किया जाता है।

कॉस्मिड के माध्यम से जीन क्लोनिंग जीवों के जीनोम में गैर-संवेदी अनुक्रमों के अध्ययन में सहायक होती है।

कुछ कॉस्मिड का निर्माण लीनियर प्लास्मिड डीएनए को p1 के डीएनए खंडों के साथ जोड़कर किया जाता है।

बैक्टीरियोफेज जिनमें कॉस-एंड होते हैं। P1 बैक्टीरियोफेज का जीनोम 115 kbp का है। इसलिए, 85 kbp का DNA।

kbp को P1 फ़ेज के शीर्ष में पैक किया जा सकता है। ये कॉस्मिड बड़े जीनों और जीन क्लोनिंग में मदद करते हैं।

बैक्टीरिया में समूह।

हानियाँ:-

- यदि दोनों में से कोई एक भी त्रुटि हो तो पैकेजिंग एंजाइम रिकॉम्बिनेंट कॉस्मिड को फाज हेड में पैक करने में विफल रहता है।

cos-ends गायब है।

- कभी-कभी एक से अधिक पुनर्संयोजित कॉस्मिड मिलकर एक बड़ा डीएनए बनाते हैं। यदि ऐसा होता है, तो पैकेजिंग

एंजाइम डीएनए को फाज के सिर में पैक करने में विफल रहता है।

- धीमी प्रतिकृति

- जीवाणु मेजबान के अंदर पुनर्संयोजन की उच्च आवृत्ति।

- ई. कोलाई होस्ट के अंदर अस्थिर होने के कारण वेक्टर आसानी से खो सकता है। 

3. फ़ेज:- 

जीवाणुभक्षी:-

बैक्टीरिया को संक्रमित करने वाले वायरस को बैक्टीरियोफेज के नाम से जाना जाता है। 

इसकी खोज फ्रेडरिक डब्ल्यू. ट्वोर्ट ने ग्रेट ब्रिटेन (1915) में और फेलिक्स डी' हेरेल ने फ्रांस (1917) में की थी। डी' हेरेल ने इस एजेंट की जीवाणुनाशक गतिविधि का वर्णन करने के लिए बैक्टीरियोफेज शब्द का प्रयोग किया, जिसका अर्थ है 'जीवाणु भक्षक'।

फ़ेज की संरचना बहुत सरल होती है, जिसमें केवल एक डीएनए (या कभी-कभी राइबोन्यूक्लिक एसिड (आरएनए)) अणु होता है जिसमें कई जीन होते हैं, जो प्रोटीन अणुओं से बने एक सुरक्षात्मक आवरण या कैप्सिड से घिरा होता है। 

वे दो जीवन चक्रों से गुजर सकते हैं:-

i. लयटिक चक्र 

ii. लाइसोजेनिक चक्र

जीवाणुभक्षी एक वाहक के रूप में:-

यह विदेशी डीएनए के बहुत बड़े टुकड़ों को स्वीकार कर सकता है। 

आनुवंशिक इंजीनियरों ने फ़ेज वैक्टर के कई व्युत्पन्न तैयार किए हैं जिनमें विभिन्न प्रकार के प्रतिबंध एंजाइमों के लिए केवल एक या दो स्थल होते हैं। 

> जिन फागे में स्टफर फ्रैगमेंट होता है, उन्हें सब्स्टिट्यूशन वेक्टर कहा जाता है क्योंकि उन्हें इस तरह से डिजाइन किया जाता है कि उनमें से एक टुकड़ा हटाया जा सके और उसकी जगह कुछ और लगाया जा सके। 

उदाहरण  :-  लैम्डा फेज, एम13 फेज, टी4, टी7 फेज, पी1 फेज आदि।

ए. एम13 फेज:- 

- बैक्टीरियोफेज एम13 को सर्वप्रथम म्यूनिख के अपशिष्ट जल से पृथक किया गया था (होफशनाइडर, 1963)। अतः इसका नाम एम13 फेज रखा गया। 

- यह एक तंतुमय फ़ेज है जिसमें 6407 न्यूक्लियोटाइड होते हैं। 

इसमें एकल-केन्द्रित वृत्ताकार डीएनए होता है। 

- इसे सैंगर ने 1982 में अनुक्रमित किया था।

- एम13 फेज का जीनोम:

एम13 को फेज वेक्टर के रूप में निर्मित करना:-

i. एम13 क्लोनिंग वेक्टर के निर्माण में पहला कदम इंटरजेनिक अनुक्रम में lacZ′ जीन को शामिल करना था। 

ii. इससे M13mp1 का निर्माण हुआ, जो X-gal अगर पर नीले रंग की पट्टिकाएँ बनाता है। 

iii. M13mp1 में lacZ′ जीन में कोई विशिष्ट प्रतिबंध स्थल नहीं है। 

iv. M13mp2 वेक्टर:- इसमें जीन के प्रारंभ के निकट हेक्सान्यूक्लियोटाइड GGATTC होता है। एक एकल न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन से यह GAATTC बन जाएगा, जो एक EcoRI साइट है। यह परिवर्तन इन विट्रो उत्परिवर्तन विधि द्वारा किया गया, जिसके परिणामस्वरूप M13mp2 प्राप्त हुआ। 

v. M13mp7 वेक्टर:- एक पॉलीलिंकर, जिसमें कई प्रतिबंध स्थल होते हैं और EcoRI चिपचिपे सिरे होते हैं। इस पॉलीलिंकर को M13mp2 के EcoRI स्थल में डाला गया, जिससे M13mp7 एक अधिक जटिल वेक्टर बन गया जिसमें चार संभावित क्लोनिंग स्थल (EcoRI, BamHI, SalI और PstI) हैं। पॉलीलिंकर को इस प्रकार डिज़ाइन किया गया है कि यह lacZ′ जीन को पूरी तरह से बाधित नहीं करता है। हालांकि इसमें बदलाव होता है, फिर भी b-गैलेक्टोसिडेज़ एंजाइम का उत्पादन होता है।

बी. पी1 फेज:-

 - P1 एक समशीतोष्ण जीवाणुभक्षी (फेज) है जो एस्चेरिचिया कोलाई और कुछ अन्य जीवाणुओं को संक्रमित करता है। 

 - जब फेज एक लाइसोजेनिक चक्र से गुजरता है, तो बैक्टीरिया में फेज जीनोम एक प्लास्मिड के रूप में मौजूद होता है। 

- अन्य फ़ेजों के विपरीत, यह मेजबान के डीएनए में एकीकृत हो जाता है। 

 - P1 में एक आइकोसाहेड्रल "सिर" होता है जिसमें डीएनए होता है, जो छह पूंछ तंतुओं वाली एक संकुचनशील पूंछ से जुड़ा होता है।

- P1 फेज का जीनोम मध्यम आकार का होता है, लगभग 93 किलोबैरिक पिन कोड (Kbp) लंबा। मेजबान में प्रवेश करने के बाद यह गोलाकार हो जाता है और प्लास्मिड के रूप में प्रतिकृति बनाता है। 

जीनोम में प्रतिकृति के दो उद्गम स्थल होते हैं, oriR जो लाइसोजेनिक चक्र के दौरान इसकी प्रतिकृति करता है और oriL जो लैटिक चरण के दौरान इसकी प्रतिकृति करता है।

- एक ऐसे बैक्टीरियोफेज पी1 क्लोनिंग सिस्टम का विकास करना जो 100 किलोबेस पेयर (केबीपी) जितने बड़े डीएनए खंडों को स्वीकार करने में सक्षम हो। 

- फ़ेज कणों में दो P1 loxP पुनर्संयोजन स्थल होते हैं जो पैक किए गए डीएनए को चक्रीयकृत करने के लिए होते हैं, जब इसे एस्चेरिचिया कोलाई के एक स्ट्रेन में इंजेक्ट किया जाता है जिसमें P1 Cre रिकॉम्बिनेज होता है, जो कि कैनामाइसिन प्रतिरोधी जीन है, ताकि चक्रीयकृत डीएनए वाले जीवाणु क्लोन का चयन किया जा सके। 

- P1 प्लास्मिड रेप्लिकॉन का उपयोग E. coli में प्रति कोशिका गुणसूत्र एक प्रति के रूप में उस DNA को स्थिर रूप से बनाए रखने के लिए किया जाता है, और एक lac प्रमोटर-नियंत्रित P1 लाइटिक रेप्लिकॉन का उपयोग DNA को पुनः पृथक करने से पहले उसे प्रवर्धित करने के लिए किया जाता है।

HAC (Human Artificial Chromosome):-

> It is first described by Harrington (1997).

> It synthesized by combining portions of alpha satellite DNA with telomeric DNA and genomic DNA into linear micro chromosomes.

> HACs are microchromosomes that can act as a new chromosome in a population of human cells. It means instead of 46 chromosomes, the cell could have 47 chromosomes with the 47th being very small,

and able to carry new genes introduced by human researchers.

> HACs range in size from 6 to 10 Mb that carry new genes introduced by human researchers.

> HACs can be used as vectors in transfer of new genes, studying their expression and mammalian chromosomal function can also be elucidated using these microchrosomes in mammalian system.

> Human artificial chromosomes are extrachromosomal DNA fragments that act as a new chromosome within the human cell.

> The use of human artificial chromosomes has increased with advances in genetic engineering as it helps overcome problems commonly associated with traditional vector systems.

> HACs can exist as single copy episomes without integration into the host chromosomes allowing long-term stable maintenance.

> Besides, there is no upper limit in the size of the DNA insert to be incorporated into a HAC as entire genomic units can be used to mimic the natural gene expression.

> In spite of numerous advantages, HACs have only been used for studies related to the structure and function of human kinetochores.

> Limitations associated with HACs are due to technical difficulties during gene loading and ill-defined structures of the vectors.

HAC (मानव कृत्रिम गुणसूत्र):-

इसका सर्वप्रथम वर्णन हैरिंगटन (1997) द्वारा किया गया था।

इसका संश्लेषण अल्फा सैटेलाइट डीएनए के कुछ हिस्सों को टेलोमेरिक डीएनए और जीनोमिक डीएनए के साथ मिलाकर रैखिक माइक्रोक्रोमोसोम में किया जाता है।

एचएसी सूक्ष्म गुणसूत्र होते हैं जो मानव कोशिकाओं के समूह में एक नए गुणसूत्र के रूप में कार्य कर सकते हैं। इसका अर्थ है कि 46 गुणसूत्रों के स्थान पर, कोशिका में 47 गुणसूत्र हो सकते हैं, जिनमें से 47वां गुणसूत्र बहुत छोटा होता है।

और मानव शोधकर्ताओं द्वारा डाले गए नए जीन को ले जाने में सक्षम।

एचएसी का आकार 6 से 10 एमबी तक होता है और इनमें मानव शोधकर्ताओं द्वारा डाले गए नए जीन होते हैं।

एचएसी का उपयोग नए जीनों के स्थानांतरण में वाहक के रूप में किया जा सकता है, उनकी अभिव्यक्ति का अध्ययन किया जा सकता है और स्तनधारी प्रणाली में इन माइक्रोक्रोसोम का उपयोग करके स्तनधारी गुणसूत्रीय कार्य को भी स्पष्ट किया जा सकता है।

मानव कृत्रिम गुणसूत्र, गुणसूत्र के बाहर पाए जाने वाले डीएनए के खंड होते हैं जो मानव कोशिका के भीतर एक नए गुणसूत्र के रूप में कार्य करते हैं।

आनुवंशिक अभियांत्रिकी में हुई प्रगति के साथ मानव कृत्रिम गुणसूत्रों का उपयोग बढ़ा है क्योंकि यह पारंपरिक वेक्टर प्रणालियों से जुड़ी सामान्य समस्याओं को दूर करने में मदद करता है।

> एचएसी मेजबान गुणसूत्रों में एकीकृत हुए बिना एकल प्रतिलिपि एपिसोम के रूप में मौजूद हो सकते हैं, जिससे दीर्घकालिक स्थिर रखरखाव संभव हो पाता है।

इसके अलावा, एचएसी में शामिल किए जाने वाले डीएनए इंसर्ट के आकार की कोई ऊपरी सीमा नहीं है क्योंकि प्राकृतिक जीन अभिव्यक्ति की नकल करने के लिए संपूर्ण जीनोमिक इकाइयों का उपयोग किया जा सकता है।

अनेक लाभों के बावजूद, एचएसी का उपयोग केवल मानव काइनेटोकोर की संरचना और कार्य से संबंधित अध्ययनों के लिए किया गया है।

एचएसी से जुड़ी सीमाएं जीन लोडिंग के दौरान तकनीकी कठिनाइयों और वैक्टर की अस्पष्ट संरचनाओं के कारण होती हैं।

Restriction Enzyme:- It is a nuclease enzyme that cleaves DNA sequence at a specific recognition sites known as restriction sites. 

Discovery:- In 1970 the first restriction endonuclease enzyme HindII was isolated. For the subsequent discovery and characterization of numerous restriction endonucleases, in 1978 Daniel Nathans, Werner Arber, and Hamilton O. Smith awarded for Nobel Prize for Physiology or Medicine.

Restriction modification system:- In bacteria, modification enzymes methylate the bacterial DNA. Methylation of bacterial DNA at the recognition sequence typically protects the own DNA of the bacteria from being cleaved by restriction enzyme.

Types:- There are two different kinds of restriction enzymes:

(1) Exonucleases:- They catalyses hydrolysis of terminal nucleotides from the end of DNA or RNA molecule either 5’to 3’ direction or 3’ to 5’ direction. Example: exonuclease I, exonuclease II etc.

(2) Endonucleases:- They can recognize specific base sequence (restriction site) within DNA or RNA molecule and cleave internal phosphodiester bonds within a DNA molecule. Example: EcoRI, Hind III, BamHI etc.

Restriction Endonuclease (RE):-

Nomenclature:- Restriction endonucleases are named according to the organism in which they were discovered, using a system of letters and numbers. 

For example, HindIII (pronounced “hindee-three”) was discovered in Haemophilus influenza (strain d). The Roman numerals are used to identify specific enzymes from bacteria that contain multiple restriction enzymes indicating the order in which restriction enzymes were discovered in a particular strain.

Classification of Restriction Endonucleases:- There are three major classes of restriction endonucleases based on the types of sequences recognized, the nature of the cut made in the DNA, and the enzyme structure -

a. Type I restriction enzymes

b. Type II restriction enzymes

c. Type III restriction enzymes

a. Type I restriction enzymes:-

> These enzymes have both restriction and modification activities. Restriction depends upon the methylation status of the target DNA.

> Cleavage occurs approximately 1000 bp away from the recognition site.

> The recognition site is asymmetrical and is composed of two specific portions in which one portion contain 3–4 nucleotides while another portion contain 4–5 nucleotides and both the parts are separated by a non-specific spacer of about 6–8 nucleotides.

> They require S-adenosylmethionine (SAM), ATP, and magnesium ions (Mg2+) for activity.

> These enzymes are composed of mainly three subunits, a specificity subunit that determines the DNA recognition site, a restriction subunit, and a modification subunit.

> Examples:- EcoB, EcoK

b. Type II restriction enzymes:-

> Restriction and modification are mediated by separate enzymes so it is possible to cleave DNA in the absence of modification. Although the two enzymes recognize the same target sequence, they can be purified separately from each other.

> Cleavage of nucleotide sequence occurs at the restriction site.

> These enzymes are used to recognize rotationally symmetrical sequence which is often referred as palindromic sequence.

> These palindromic binding site may either be interrupted (e.g. BstEII recognizes the sequence 5´-GGTNACC-3´, where N can be any nucleotide) or continuous (e.g. KpnI recognizes the sequence 5´-GGTACC-3´).

> They require only Mg2+ as a cofactor and ATP is not needed for their activity.

> Type II endonucleases are widely used for mapping and reconstructing DNA in vitro because they recognize specific sites and cleave just at these sites.

> Examples:- EcoR I, BamH I

c. Type III restriction enzymes:-

> These enzymes recognize and methylate the same DNA sequence but cleave 24–26 bp away.

> They have two different subunits, in which one subunit (M) is responsible for recognition and modification of DNA sequence and other subunit (R) has nuclease action.

> Mg+2 ions, ATP are needed for DNA cleavage and process of cleavage is stimulated by SAM.

> Cleave only one strand. Two recognition sites in opposite orientation are necessary to break the DNA duplex.

> Examples:- EcoP I, Hinf III

Applications:- In various applications related to genetic engineering DNA is cleaved by using these

restriction enzymes.

i. They are used in the process of insertion of genes into plasmid vectors during gene cloning and protein expression experiments.

ii. Restriction enzymes can also be used to distinguish gene alleles by specifically recognizing single base changes in DNA known as single nucleotide polymorphisms (SNPs). This is only possible if a mutation alters the restriction site present in the allele.

iii. Restriction enzymes are used for Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) analysis for identifying individuals or strains of a particular species.

DNA Ligase:- It is a specific type of enzyme that facilitates the joining of DNA strands together by catalyzing the formation of a phosphodiester bond. DNA ligase is used in DNA repair, DNA replication and genetic engineering.

Types:-

a. E. coli DNA ligase:- 

> It is encoded by the lig gene. DNA ligase in E. coli, as well as most prokaryotes, uses energy gained by cleaving nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to create the phosphodiester bond. 

> It does not ligate blunt-ended DNA and cannot join RNA to DNA efficiently. 

> The activity of E. coli DNA ligase can be enhanced by DNA polymerase - I at the right concentrations. 

b. T4 DNA ligase:- 

> The DNA ligase from bacteriophage T4 (a bacteriophage that infects Escherichia coli bacteria). 

> The T4 ligase is the most-commonly used in genetic engineering.

> It can ligate either cohesive or blunt ends of DNA, oligonucleotides, as well as RNA and RNA-DNA hybrids, but not single-stranded nucleic acids. 

> It can also ligate blunt-ended DNA with much greater efficiency than E. coli DNA ligase. 

> T4 DNA ligase cannot utilize NAD and it has an absolute requirement for ATP as a cofactor. 

> The optimal incubation temperature for T4 DNA ligase is 16 °C.

c. Mammalian DNA ligase:- In mammals, there are four specific types of ligase -

i. DNA ligase I:- It ligates the nascent DNA of the lagging strand after the Ribonuclease H has removed the RNA primer from the Okazaki fragments.

ii. DNA ligase III:- Complexes with DNA repair protein XRCC1 to aid in sealing DNA during the process of nucleotide excision repair and recombinant fragments. Of the all known mammalian DNA ligases, only Lig III has been found to be present in mitochondria.

iii. DNA ligase IV:- Complexes with XRCC4. It catalyzes the final step in the non-homologous end joining DNA double-strand break repair pathway. It is also required for V(D)J recombination, the process that generates diversity in immunoglobulin and T-cell receptor loci during immune system development.

Note:- DNA ligase from eukaryotes and some microbes uses adenosine triphosphate (ATP) rather than NAD.

d. Thermostable DNA ligase:-

> Derived from a thermophilic bacterium, the enzyme is stable and active at much higher temperatures than conventional DNA ligases. 

> Its half-life is 48 hours at 65 °C and greater than 1 hour at 95 °C. 

> Ampligase DNA Ligase has been shown to be active for at least 500 thermal cycles (94 °C/80 °C) or 16 hours of cycling. This exceptional thermostability permits extremely high hybridization stringency and ligation specificity.

जेनेटिक इंजीनियरिंग में आवश्यक रिस्ट्रिक्शन एंडोन्यूक्लिएस और अन्य एंजाइम:-

प्रतिबंध एंजाइम:-  यह एक न्यूक्लिएज एंजाइम है जो डीएनए अनुक्रम को विशिष्ट पहचान स्थलों पर विभाजित करता है जिन्हें प्रतिबंध स्थल कहा जाता है। 

खोज:-  1970 में पहला रिस्ट्रिक्शन एंडोन्यूक्लिएज़ एंजाइम HindII पृथक किया गया। इसके बाद अनेक रिस्ट्रिक्शन एंडोन्यूक्लिएज़ की खोज और उनके लक्षण वर्णन के लिए, 1978 में डेनियल नैथंस, वर्नर आर्बर और हैमिल्टन ओ. स्मिथ को शरीर क्रिया विज्ञान या चिकित्सा के क्षेत्र में नोबेल पुरस्कार से सम्मानित किया गया।

प्रतिबंध संशोधन प्रणाली:-  जीवाणुओं में, संशोधन एंजाइम जीवाणु डीएनए का मिथाइलेशन करते हैं। पहचान अनुक्रम पर जीवाणु डीएनए का मिथाइलेशन आमतौर पर जीवाणु के अपने डीएनए को प्रतिबंध एंजाइम द्वारा विखंडित होने से बचाता है।

प्रकार:-  प्रतिबंध एंजाइम दो प्रकार के होते हैं:

(1) एक्सोन्यूक्लिएज़:-  ये डीएनए या आरएनए अणु के अंतिम छोर पर स्थित टर्मिनल न्यूक्लियोटाइड के हाइड्रोलिसिस को उत्प्रेरित करते हैं, चाहे दिशा 5' से 3' की ओर हो या 3' से 5' की ओर। उदाहरण: एक्सोन्यूक्लिएज़ I, एक्सोन्यूक्लिएज़ II आदि।

(2) एंडोन्यूक्लिएज़:-  ये डीएनए या आरएनए अणु के भीतर विशिष्ट बेस अनुक्रम (प्रतिबंध स्थल) को पहचान सकते हैं और डीएनए अणु के भीतर आंतरिक फॉस्फोडिएस्टर बंधों को तोड़ सकते हैं। उदाहरण: इकोआरआई, हिंड III, बैमएचआई आदि।

प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिएज़ (आरई):-

नामकरण:-  प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिएस का नाम उस जीव के अनुसार रखा जाता है जिसमें उनकी खोज की गई थी, इसके लिए अक्षरों और संख्याओं की एक प्रणाली का उपयोग किया जाता है। 

उदाहरण के लिए, HindIII (उच्चारण “हिंडी-थ्री”) की खोज हीमोफिलस इन्फ्लुएंजा (स्ट्रेन d) में हुई थी। रोमन अंकों का उपयोग उन बैक्टीरिया से विशिष्ट एंजाइमों की पहचान करने के लिए किया जाता है जिनमें कई प्रतिबंध एंजाइम होते हैं, जो एक विशेष स्ट्रेन में प्रतिबंध एंजाइमों की खोज के क्रम को दर्शाते हैं।

प्रतिबंध एंडोन्यूक्लियेस का वर्गीकरण:-  मान्यता प्राप्त अनुक्रमों के प्रकार, डीएनए में किए गए कट की प्रकृति और एंजाइम संरचना के आधार पर प्रतिबंध एंडोन्यूक्लियेस के तीन प्रमुख वर्ग हैं।

ए. टाइप I प्रतिबंध एंजाइम

बी. टाइप II प्रतिबंध एंजाइम

सी. टाइप III प्रतिबंध एंजाइम

ए. टाइप I प्रतिबंध एंजाइम:-

इन एंजाइमों में प्रतिबंध और संशोधन दोनों प्रकार की गतिविधियाँ होती हैं। प्रतिबंध लक्ष्य डीएनए की मिथाइलेशन स्थिति पर निर्भर करता है।

> विखंडन पहचान स्थल से लगभग 1000 बीपी की दूरी पर होता है।

> पहचान स्थल असममित होता है और दो विशिष्ट भागों से बना होता है, जिसमें एक भाग में 3-4 न्यूक्लियोटाइड होते हैं जबकि दूसरे भाग में 4-5 न्यूक्लियोटाइड होते हैं और दोनों भाग लगभग 6-8 न्यूक्लियोटाइड के एक गैर-विशिष्ट स्पेसर द्वारा अलग किए जाते हैं।

> इनकी सक्रियता के लिए एस-एडेनोसिलमेथियोनिन (एसएएम), एटीपी और मैग्नीशियम आयनों (एमजी2+) की आवश्यकता होती है।

ये एंजाइम मुख्य रूप से तीन उपइकाइयों से बने होते हैं: एक विशिष्टता उपइकाई जो डीएनए पहचान स्थल को निर्धारित करती है, एक प्रतिबंध उपइकाई और एक संशोधन उपइकाई।

उदाहरण  :-  EcoB, EcoK

बी. टाइप II प्रतिबंध एंजाइम:-

प्रतिबंध और संशोधन अलग-अलग एंजाइमों द्वारा नियंत्रित होते हैं, इसलिए संशोधन के बिना भी डीएनए को विखंडित करना संभव है। हालांकि दोनों एंजाइम एक ही लक्ष्य अनुक्रम को पहचानते हैं, फिर भी उन्हें एक दूसरे से अलग-अलग शुद्ध किया जा सकता है।

> न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम का विखंडन प्रतिबंध स्थल पर होता है।

इन एंजाइमों का उपयोग घूर्णी रूप से सममित अनुक्रम को पहचानने के लिए किया जाता है, जिसे अक्सर पैलिंड्रोमिक अनुक्रम कहा जाता है।

ये पैलिंड्रोमिक बंधन स्थल या तो बाधित हो सकते हैं (उदाहरण के लिए BstEII अनुक्रम 5´-GGTNACC-3´ को पहचानता है, जहाँ N कोई भी न्यूक्लियोटाइड हो सकता है) या निरंतर (उदाहरण के लिए KpnI अनुक्रम 5´-GGTACC-3´ को पहचानता है)।

> उन्हें सहकारक के रूप में केवल Mg2+ की आवश्यकता होती है और उनकी गतिविधि के लिए ATP की आवश्यकता नहीं होती है।

टाइप II एंडोन्यूक्लियेस का उपयोग इन विट्रो में डीएनए की मैपिंग और पुनर्निर्माण के लिए व्यापक रूप से किया जाता है क्योंकि वे विशिष्ट स्थलों को पहचानते हैं और केवल इन्हीं स्थलों पर विखंडन करते हैं।

उदाहरण  :-  EcoR I, BamH I

सी. टाइप III प्रतिबंध एंजाइम:-

ये एंजाइम एक ही डीएनए अनुक्रम को पहचानते और मिथाइलेट करते हैं, लेकिन 24-26 बीपी दूर से काटते हैं।

इनमें दो अलग-अलग उपइकाइयाँ होती हैं, जिनमें से एक उपइकाई (एम) डीएनए अनुक्रम की पहचान और संशोधन के लिए जिम्मेदार होती है और दूसरी उपइकाई (आर) में नाभिकीय क्रिया होती है।

डीएनए के विखंडन के लिए Mg+2 आयनों और ATP की आवश्यकता होती है और विखंडन की प्रक्रिया SAM द्वारा उत्तेजित होती है।

केवल एक ही स्ट्रैंड को विभाजित करें। डीएनए डुप्लेक्स को तोड़ने के लिए विपरीत दिशा में स्थित दो पहचान स्थलों का होना आवश्यक है।

उदाहरण  :-  इकोपी I, हिन्फ III

अनुप्रयोग:-  आनुवंशिक अभियांत्रिकी से संबंधित विभिन्न अनुप्रयोगों में डीएनए को इन उपकरणों का उपयोग करके विखंडित किया जाता है।

प्रतिबंधित एंजाइम।

i. जीन क्लोनिंग और प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रयोगों के दौरान प्लास्मिड वैक्टर में जीन डालने की प्रक्रिया में इनका उपयोग किया जाता है।

ii. जीन एलील्स को अलग करने के लिए रिस्ट्रिक्शन एंजाइमों का भी उपयोग किया जा सकता है, जो डीएनए में एकल न्यूक्लियोटाइड पॉलीमॉर्फिज्म (एसएनपी) के रूप में जाने जाने वाले एकल बेस परिवर्तनों को विशेष रूप से पहचानते हैं। यह तभी संभव है जब उत्परिवर्तन एलील में मौजूद रिस्ट्रिक्शन साइट को बदल दे।

iii. किसी विशेष प्रजाति के व्यक्तियों या उपभेदों की पहचान करने के लिए प्रतिबंध खंड लंबाई बहुरूपता (आरएफएलपी) विश्लेषण हेतु प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग किया जाता है।

डीएनए लाइगेज:-  यह एक विशेष प्रकार का एंजाइम है जो फॉस्फोडिएस्टर बॉन्ड के निर्माण को उत्प्रेरित करके डीएनए स्ट्रैंड्स को आपस में जोड़ने में मदद करता है। डीएनए लाइगेज का उपयोग डीएनए की मरम्मत, डीएनए प्रतिकृति और आनुवंशिक इंजीनियरिंग में किया जाता है।

प्रकार:-

ए. ई. कोलाई डीएनए लाइगेज:- 

यह lig जीन द्वारा एन्कोड किया जाता है। ई. कोलाई में डीएनए लाइगेज, साथ ही अधिकांश प्रोकैरियोट्स में, फॉस्फोडिएस्टर बॉन्ड बनाने के लिए निकोटिनमाइड एडेनिन डिन्यूक्लियोटाइड (एनएडी) को तोड़कर प्राप्त ऊर्जा का उपयोग करता है। 

यह कुंद सिरे वाले डीएनए को जोड़ नहीं पाता है और आरएनए को डीएनए से कुशलतापूर्वक नहीं जोड़ सकता है। 

ई. कोलाई डीएनए लाइगेज की गतिविधि को डीएनए पॉलीमरेज़-I द्वारा उचित सांद्रता पर बढ़ाया जा सकता है। 

बी. टी4 डीएनए लाइगेज:- 

बैक्टीरियोफेज टी4 (एक बैक्टीरियोफेज जो एस्चेरिचिया कोलाई बैक्टीरिया को संक्रमित करता है) से प्राप्त डीएनए लाइगेज। 

> आनुवंशिक अभियांत्रिकी में टी4 लाइगेज का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है।

यह डीएनए के संसंजक या कुंद सिरों, ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स, साथ ही आरएनए और आरएनए-डीएनए संकरों को जोड़ सकता है, लेकिन एकल-स्ट्रैंडेड न्यूक्लिक एसिड को नहीं। 

यह ई. कोलाई डीएनए लाइगेज की तुलना में कहीं अधिक दक्षता के साथ कुंद सिरे वाले डीएनए को भी जोड़ सकता है। 

> टी4 डीएनए लाइगेज एनएडी का उपयोग नहीं कर सकता है और इसे सहकारक के रूप में एटीपी की पूर्ण आवश्यकता होती है। 

टी4 डीएनए लाइगेज के लिए इष्टतम ऊष्मायन तापमान 16 डिग्री सेल्सियस है।

सी. स्तनधारी डीएनए लाइगेज:-  स्तनधारियों में चार विशिष्ट प्रकार के लाइगेज पाए जाते हैं -

i. डीएनए लाइगेज I:-  यह राइबोन्यूक्लेज H द्वारा ओकाज़ाकी खंडों से आरएनए प्राइमर को हटाने के बाद लैगिंग स्ट्रैंड के नवजात डीएनए को जोड़ता है।

ii. डीएनए लाइगेज III:-  यह डीएनए मरम्मत प्रोटीन XRCC1 के साथ मिलकर न्यूक्लियोटाइड एक्सिशन रिपेयर और रिकॉम्बिनेंट फ्रेग्मेंट्स की प्रक्रिया के दौरान डीएनए को सील करने में सहायता करता है। सभी ज्ञात स्तनधारी डीएनए लाइगेज में से केवल लाइगेज III ही माइटोकॉन्ड्रिया में पाया गया है।

iii. डीएनए लाइगेज IV:-  XRCC4 के साथ कॉम्प्लेक्स बनाता है। यह डीएनए के दोहरे स्ट्रैंड के टूटने की मरम्मत के लिए गैर-समरूप छोरों को जोड़ने की प्रक्रिया के अंतिम चरण को उत्प्रेरित करता है। यह V(D)J पुनर्संयोजन के लिए भी आवश्यक है, जो प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास के दौरान इम्युनोग्लोबुलिन और टी-सेल रिसेप्टर लोकी में विविधता उत्पन्न करने वाली प्रक्रिया है।

नोट:-  यूकेरियोट्स और कुछ सूक्ष्मजीवों में पाए जाने वाले डीएनए लाइगेज, एनएडी के बजाय एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) का उपयोग करते हैं।

d. ऊष्मास्थिर डीएनए लाइगेज:-

ऊष्मा-प्रेमी जीवाणु से प्राप्त यह एंजाइम, पारंपरिक डीएनए लाइगेस की तुलना में कहीं अधिक तापमान पर स्थिर और सक्रिय होता है। 

65 डिग्री सेल्सियस पर इसकी अर्धायु 48 घंटे है और 95 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे से अधिक है। 

> एम्प्लीगेज डीएनए लाइगेज कम से कम 500 तापीय चक्रों (94 °C/80 °C) या 16 घंटे के चक्रण के लिए सक्रिय पाया गया है। यह असाधारण तापस्थिरता अत्यंत उच्च संकरण कठोरता और लाइगेशन विशिष्टता की अनुमति देती है।

Agrobacterium tumefaciens:- It causes Crown gall disease in angiosperm plants. Ti-plasmid is found in it.

Mechanism of Gene Transfer:-

•  The T - DNA portion of the Ti - plasmid has the property that it can integrate into the plant's genome.

•  Leaf pieces release the Aceto - Syringine chemical that activates the Vir - Operon of T - DNA.

•  Once activated, the T-DNA portion separates from the plasmid and enters into many plant cells.

•  Now this T-DNA integrates into the genome by going into the nucleus.

•  This results in stable transformation of the plant.

एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियंस :-  यह एंजियोस्पर्म पौधों में क्राउन गॉल रोग का कारण बनता है। इसमें टीआई-प्लास्मिड पाया जाता है।

जीन स्थानांतरण की प्रक्रिया:-

•   टीआई-प्लास्मिड के टी-डीएनए भाग में यह गुण होता है कि यह पौधे के जीनोम में एकीकृत हो सकता है।

•   पत्ती के टुकड़े एसिटो-सिरिंगिन नामक रसायन छोड़ते हैं जो टी-डीएनए के विर-ऑपेरॉन को सक्रिय करता है।

•   सक्रिय होने के बाद, टी-डीएनए भाग प्लास्मिड से अलग हो जाता है और कई पादप कोशिकाओं में प्रवेश कर जाता है।

•   अब यह टी-डीएनए केंद्रक में जाकर जीनोम में एकीकृत हो जाता है।

•   इसके परिणामस्वरूप पौधे का स्थिर रूपांतरण होता है।

Direct Gene Transfer:- When stable transformation is achieved by incorporating the desired gene into the genome of plant cells without the help of any biological factor, it is called direct gene transfer.

1. Gene gun method:-

> It is a physical method of gene transfer.

> It is also called Biolistic method.

> In this, tungsten or gold particles of 1-2µm diameter are coated with DNA and fired them into the cell by a particle gun.

>  Gold is expensive, but it is less harmful to cells.

> The cost of a particle gun is almost 15 lakhs.

> The particles are accelerated by compressed helium gas in the particle gun.

> DNA reaches inside the nucleus and becomes incorporated into the plant's genome.

> By this method, the gene is transferred to the meristem and embryo.

2. PEG mediated Gene Transfer:-

> It is a chemical method of gene transfer.

> In this method gene transfer is induced by PEG. (PEG = Poly Ethylene Glycol)

> Transformation medium is added in a beaker that has a high concentration of Mg2 + ions.

> Now plant protoplasts are put into this nutritive medium.

> Now put the desired gene in the beaker.

> Now take the pH to 8.

> Now add 20% PEG.

> Now decrease the concentration of PEG and increase the concentration of Ca2+ ions.

> Now incubate for some time.

> The transformation frequency increases 10 to 1000 times when plant protoplasts are transferred to ice after heat-shock at 45°C for 5 minutes just before adding DNA.

3. Electroporation:- Introduction of DNA into plant cells by making minute pores in the plant cell membrane is called as electroporation.

> This method involves suspension of plant protoplasts in a suitable ionic solution containing linearized recombinant plasmid DNA.

> This mixture is then exposed to low voltage-long pulses or high voltage short pulses for the desired number of cycles.

> The electrical pulses are thought to induce transient pores in the plasma lemma through which the DNA molecules are incorporated.

> Treated protoplasts are then cultured to obtain cell colonies and plants.

4. Microinjection:-

> It involving the mechanical insertion of the desirable DNA into a target cell.

> The target cell may be the one identified from intact cells, protoplasts, callus, embryos, meristems, etc.

> Microinjection is used for the transfer of cellular organelles and for the manipulation of chromosomes. > The technique of microinjection involves the transfer of the gene through a micropipette (0.5-10.0 pm tip) into the cytoplasm/nucleus of a plant cell or protoplast.

> While the gene transfer is done, the recipient cells are kept immobilized in agarose embedding, and held by a suction holding pipette. > As the process of microinjection is complete, the transformed cell is cultured and grown to develop into a transgenic plant.

> In fact, transgenic tobacco and Brassica napus have been developed by this approach.

> The major limitations of microinjection are that it is slow, expensive, and has to be performed by trained and skilled personnel.

प्रत्यक्ष  जीन  स्थानांतरण :-  जब किसी जैविक कारक की सहायता के बिना वांछित जीन को पादप कोशिकाओं के जीनोम में शामिल करके स्थायी रूपांतरण प्राप्त किया जाता है, तो इसे प्रत्यक्ष जीन स्थानांतरण कहा जाता है।

1.  जीन गन विधि :-

यह  जीन स्थानांतरण की एक भौतिक विधि है।

इसे  बायोलिस्टिक विधि भी कहा जाता है।

इसमें , 1-2 माइक्रोमीटर व्यास वाले टंगस्टन या सोने के कणों को डीएनए से लेपित किया जाता है और एक पार्टिकल गन द्वारा उन्हें कोशिका में दागा जाता है । 

सोना महंगा है, लेकिन यह कोशिकाओं के लिए कम हानिकारक है।  

पार्टिकल गन की कीमत लगभग 15 लाख रुपये है ।

पार्टिकल गन में संपीड़ित हीलियम गैस द्वारा कणों को त्वरित किया जाता है ।

डीएनए केंद्रक के अंदर पहुँच जाता है और पौधे के जीनोम में शामिल हो जाता है।

इस विधि द्वारा जीन को मेरिस्टेम और भ्रूण में स्थानांतरित किया जाता है । 

2. पीईजी मध्यस्थता द्वारा जीन स्थानांतरण:-    

यह  जीन स्थानांतरण की एक रासायनिक विधि है।

इस विधि में जीन स्थानांतरण को पीईजी ( PEG = पॉली एथिलीन ग्लाइकॉल) द्वारा प्रेरित किया जाता है ।

>  एक बीकर में, जिसमें Mg2+ आयनों की उच्च सांद्रता होती है, रूपांतरण माध्यम मिलाया जाता है।

अब पादप प्रोटोप्लास्ट को इस पोषक माध्यम में रखा जाता है।

अब वांछित जीन को बीकर में डालें।

अब pH को 8 तक ले जाएं।

अब  इसमें 20% पीईजी मिलाएं।

अब PEG की सांद्रता घटाएं और Ca2+ आयनों की सांद्रता बढ़ाएं।

अब इसे कुछ समय के लिए निष्क्रिय अवस्था में रखें।

जब पादप प्रोटोप्लास्ट को डीएनए डालने से ठीक पहले 5 मिनट के लिए 45°C पर हीट-शॉक देने के बाद बर्फ में स्थानांतरित किया जाता है, तो रूपांतरण आवृत्ति 10 से 1000 गुना तक बढ़ जाती है । 

3. इलेक्ट्रोपोरेशन:- पादप कोशिका झिल्ली में सूक्ष्म छिद्र बनाकर पादप कोशिकाओं में डीएनए का प्रवेश कराना इलेक्ट्रोपोरेशनकहलाता है

इस विधि में पादप प्रोटोप्लास्ट को रेखीयकृत युक्त उपयुक्त आयनिक विलयन में निलंबित करना शामिल है। पुनर्संयोजित प्लास्मिड डीएनए।

इसके बाद इस मिश्रण को वांछित संख्या में चक्रों के लिए कम वोल्टेज वाले लंबे पल्स या उच्च वोल्टेज वाले छोटे पल्स के संपर्क में लाया जाता है।

ऐसा माना जाता है कि विद्युत स्पंदन प्लाज्मा लेम्मा में क्षणिक छिद्र उत्पन्न करते हैं, जिनके माध्यम से डीएनए अणु समाहित हो जाते हैं।

उपचारित प्रोटोप्लास्ट को फिर संवर्धित करके कोशिका कॉलोनियां और पौधे प्राप्त किए जाते हैं।

4. माइक्रोइंजेक्शन:-

इसमें वांछित डीएनए को लक्षित कोशिका में यांत्रिक रूप से सम्मिलित करना शामिल है।

लक्षित कोशिका वह हो सकती है जिसे अक्षुण्ण कोशिकाओं, प्रोटोप्लास्ट, कैलस, भ्रूण, मेरिस्टेम आदि से पहचाना गया हो।

माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग कोशिकीय अंगों के स्थानांतरण और गुणसूत्रों के हेरफेर के लिए किया जाता है। माइक्रोइंजेक्शन की तकनीक में माइक्रोपिपेट (0.5-10.0 pm) के माध्यम से जीन का स्थानांतरण शामिल है। किसी पादप कोशिका या प्रोटोप्लास्ट के कोशिका द्रव्य/नाभिक में (नोक के सिरे से)।

जीन स्थानांतरण के दौरान, प्राप्तकर्ता कोशिकाओं को एगारोज एम्बेडिंग में स्थिर रखा जाता है, और एक सक्शन होल्डिंग पिपेट द्वारा पकड़कर रखा जाता है। माइक्रोइंजेक्शन की प्रक्रिया पूरी होने के बाद, रूपांतरित कोशिका को संवर्धित किया जाता है और विकसित होने तक बढ़ाया जाता है। एक ट्रांसजेनिक पौधे में।

दरअसल, इसी पद्धति से ट्रांसजेनिक तंबाकू और ब्रासिका नैपस विकसित किए गए हैं।

माइक्रोइंजेक्शन की प्रमुख सीमाएं यह हैं कि यह धीमी, महंगी है और इसे प्रशिक्षित और कुशल कर्मियों द्वारा ही किया जाना चाहिए।