2017 Solved Old Paper (BOT - 304D) New OK

Cosmids:-
> It is first described by Collins and Hohn in 1978.
> It is formed by joining ends of a linearized plasmid DNA with cos-site of lambda DNA.
> It is the commonly used cloning vector suitable for cloning large DNA fragments upto 45 kbp.
> Cosmid has an origin of replication, selectable markers, and gene cloning sites of plasmid DNA.
Salient features:-
i. Cosmid is a circular ds DNA.
ii. It has two complementary single-stranded regions at both ends of a plasmid DNA. The two cos-ends form a duplex by base pairing.
iii. The cosmid DNA does not code for phage proteins and host cell lysis.
iv. It does not involve in multiplication of phage particles.
v. It has an origin of replication from plasmid DNA for independent replication.
vi. It has selectable marker genes and gene cloning sites of plasmid DNA
vii. The cosmid DNA is packed within protein coat of bacteriophage to form inactive phage particles. Cos-site is a prerequsites for invitro packaging of cosmid in phage protein coat.
viii. After infection, the cosmid DNA does not integrate into host chromosomal DNA. It exits as a definite extra chromosomal DNA and replicates independently.
Examples:-
i. Cosmid pLFR5:- 
- It is 6 kbp in size.
- It is constructed from E.coli plasmid pBR322 and two cos-ends of lambda DNA.
ii. Cosmid pJB8:-
- It is 5.4 kbp in size. 
- It is constructed from the plasmid pBR322 and cos sites of lambda DNA.
iii. Cosmid pHC79:-
- It is 6.5 kbp in size.
- It is constructed from pBR322 and cos-sites of lambda DNA.
Advantages:-
- Cosmid pick up relatively larger DNA fragments than the plasmid do.
- As cosmids pick up large DNA fragments, they are used to establish gene libraries
- Gene cloning through cosmids helps in the study of non-sence sequences in the genome of organisms.
- Some cosmids are constructed by joining a linearized plasmid DNA with DNA fragments of p1
bacteriophage that have cos-ends. The P1 bacteriophage has the genome of 115 kbp. So, a DNA of 85
kbp can be packaged into the head of P1 phage. These cosmids help to clone large genes and gene
clusters in bacteria.
Disadvantages:-
- The packaging enzyme fails to pack recombinant cosmids into the phage head, if any one of the two
cos-ends is missing.
- Sometimes more than one recombinant cosmid join together to form a large DNA. If so, the packaging
enzyme fails to pack the DNA into the phage head.
- Slower replication
- Higher frequency of recombination inside bacterial host.
- Unstable inside E.coli host and thus easy to lose vector. 
कॉस्मिड:-
इसका सर्वप्रथम वर्णन कोलिन्स और होन ने 1978 में किया था।
इसका निर्माण रेखीयकृत प्लास्मिड डीएनए के सिरों को लैम्डा डीएनए के कोस-साइट से जोड़कर किया जाता है।
यह आमतौर पर इस्तेमाल होने वाला क्लोनिंग वेक्टर है जो 45 केबीपी तक के बड़े डीएनए खंडों की क्लोनिंग के लिए उपयुक्त है।
कॉस्मिड में प्रतिकृति का उद्गम स्थल, चयन योग्य मार्कर और प्लास्मिड डीएनए के जीन क्लोनिंग स्थल होते हैं।
प्रमुख विशेषताएं:-
i. कॉस्मिड एक वृत्ताकार डीएस डीएनए है।
ii. इसमें प्लास्मिड डीएनए के दोनों सिरों पर दो पूरक एकल-अण्डाकार क्षेत्र होते हैं। दोनों सह-छोर क्षार युग्मन द्वारा एक द्विभुज बनाते हैं।
iii. कॉस्मिड डीएनए, फ़ेज प्रोटीन और मेजबान कोशिका के विघटन के लिए कोड नहीं करता है।
iv. इसमें फ़ेज कणों का गुणन शामिल नहीं होता है।
v. इसमें स्वतंत्र प्रतिकृति के लिए प्लास्मिड डीएनए से प्रतिकृति का उद्गम होता है।
vi. इसमें चयन योग्य मार्कर जीन और प्लास्मिड डीएनए के जीन क्लोनिंग स्थल होते हैं।
vii. कॉस्मिड डीएनए को जीवाणुभेज के प्रोटीन आवरण के भीतर पैक करके निष्क्रिय फ़ेज कण बनाए जाते हैं। कॉस्मिड को फ़ेज प्रोटीन आवरण में इन विट्रो पैकेजिंग के लिए कॉस-साइट एक पूर्वापेक्षा है।
viii. संक्रमण के बाद, कॉस्मिड डीएनए मेजबान गुणसूत्र डीएनए में एकीकृत नहीं होता है। यह एक निश्चित अतिरिक्त गुणसूत्र डीएनए के रूप में मौजूद रहता है और स्वतंत्र रूप से प्रतिकृति करता है।
उदाहरण:-
i. कॉस्मिड pLFR5:- 
इसका आकार 6 केबीपी है।
- इसका निर्माण ई.कोलाई प्लास्मिड pBR322 और लैम्डा डीएनए के दो कॉस-छोरों से किया गया है।
ii. कॉस्मिड pJB8:-
इसका आकार 5.4 केबीपी है। 
- इसका निर्माण प्लास्मिड pBR322 और लैम्डा डीएनए के cos साइट्स से किया गया है।
iii. कॉस्मिड pHC79:-
इसका आकार 6.5 केबीपी है।
- इसका निर्माण pBR322 और लैम्डा डीएनए के cos-साइटों से किया गया है।
लाभ:-
कॉस्मिड, प्लास्मिड की तुलना में अपेक्षाकृत बड़े डीएनए खंडों को ग्रहण करते हैं।
कॉस्मिड द्वारा डीएनए के बड़े खंडों को ग्रहण करने के कारण, इनका उपयोग जीन लाइब्रेरी स्थापित करने के लिए किया जाता है।
कॉस्मिड के माध्यम से जीन क्लोनिंग जीवों के जीनोम में गैर-संवेदी अनुक्रमों के अध्ययन में सहायक होती है।
कुछ कॉस्मिड का निर्माण लीनियर प्लास्मिड डीएनए को p1 के डीएनए खंडों के साथ जोड़कर किया जाता है।
बैक्टीरियोफेज जिनमें कॉस-एंड होते हैं। P1 बैक्टीरियोफेज का जीनोम 115 kbp का है। इसलिए, 85 kbp का DNA।
kbp को P1 फ़ेज के शीर्ष में पैक किया जा सकता है। ये कॉस्मिड बड़े जीनों और जीन क्लोनिंग में मदद करते हैं।
बैक्टीरिया में समूह।
हानियाँ:-
- यदि दोनों में से कोई एक भी त्रुटि हो तो पैकेजिंग एंजाइम रिकॉम्बिनेंट कॉस्मिड को फाज हेड में पैक करने में विफल रहता है।
cos-ends गायब है।
- कभी-कभी एक से अधिक पुनर्संयोजित कॉस्मिड मिलकर एक बड़ा डीएनए बनाते हैं। यदि ऐसा होता है, तो पैकेजिंग
एंजाइम डीएनए को फाज के सिर में पैक करने में विफल रहता है।
- धीमी प्रतिकृति
- जीवाणु मेजबान के अंदर पुनर्संयोजन की उच्च आवृत्ति।
- ई. कोलाई होस्ट के अंदर अस्थिर होने के कारण वेक्टर आसानी से खो सकता है। 
Phages:- 
Bacteriophage:-
> Virus that infect bacteria is known as bacteriophage. 
> It was discovered by Frederick.W.Twort in Great Britian (1915) and Felix d’ Herelle in France(1917). > D’ Herelle coined the term bacteriophage meaning ‘bacterial eater’ to describe the agent’s bacteriocidal activity.
> Phages are very simple in structure, consisting merely of a DNA (or occasionally ribonucleic acid (RNA)) molecule carrying a number of genes,surrounded by a protective coat or capsid made up of protein molecules. 
> They can undergo two life cycle:-
i. Lytic cycle 
ii. Lysogenic cycle
Bacteriophage as a vector:-
> It can accept very large pieces of foreign DNA. 
> Genetic engineers have constructed numerous derivatives of phage vectors that contain only one or two sites for a variety of restriction enzymes. 
> Phage that have a stuffer fragment are called substitution vectors because they are designed to have a piece removed and substituted with something else. 
> Examples:- Lambda phage, M13 phage, T4,T7 phage, P1 phage etc.
a. M13 PHAGE:- 
- Bacteriophage M13 was first isolated from wastewater in Munich (Hofschneider, 1963). Hence named as M13 phage. 
- It is a filamentous phage which has 6407 nucleotides. 
- It possess single stranded circular DNA. 
- It was sequenced by Sanger in 1982.
- Genome of M13 phage:
Construction of M13 as phage vector:-
i. The first step in construction of an M13 cloning vector was to introduce the lacZ′ gene into the intergenic sequence. 
ii. This gave rise to M13mp1, which forms blue plaques on X-gal agar. 
iii. M13mp1 does not possess any unique restriction sites in the lacZ′ gene. 
iv. M13mp2 vector:- It contains the hexanucleotide GGATTC near the start of the gene. A single nucleotide change would make this GAATTC, which is an EcoRI site. This alteration was carried out using in vitro mutagenesis, resulting in M13mp2. 
v. M13mp7 vector:- A polylinker, which consists of a series of restriction sites and has EcoRI sticky ends. This polylinker was inserted into the EcoRI site of M13mp2, to give M13mp7 a more complex vector with four possible cloning sites (EcoRI, BamHI, SalI, and PstI). The polylinker is designed so that it does not totally disrupt the lacZ′ gene. Although it is altered, b-galactosidase enzyme is still produced.
b. P1 PHAGE:-
 - P1 is a temperate bacteriophage (phage) that infects Escherichia coli and a some other bacteria. 
 - When undergoing a lysogenic cycle the phage genome exists as a plasmid in the bacterium. 
- Unlike other phages it integrate into the host DNA. 
 - P1 has an icosahedral "head" containing the DNA attached to a contractile tail with six tail fibers.
- The genome of the P1 phage is moderately large, around 93Kbp in length. Once inserted into the host it circularizes and replicates as a plasmid. 
- The genome contains two origins of replication, oriR which replicates it during the lysogenic cycle and oriL which replicates it during the lytic stage.
- The development of a bacteriophage P1 cloning system capable of accepting DNA fragments as large as 100 kilobase pairs (kbp). 
- Phage particles has two P1 loxP recombination sites to cyclize the packaged DNA once it has been injected into a strain of Escherichia coli containing the P1 Cre recombinase, a kanamycin resistant gene to select bacterial clones containing the cyclized DNA. 
- P1 plasmid replicon to stably maintain that DNA in E. coli at one copy per cell chromosome, and a lac promoter-regulated P1 lytic replicon to amplify the DNA before it is reisolated.
फ़ेज:- 
जीवाणुभक्षी:-
बैक्टीरिया को संक्रमित करने वाले वायरस को बैक्टीरियोफेज के नाम से जाना जाता है। 
इसकी खोज फ्रेडरिक डब्ल्यू. ट्वोर्ट ने ग्रेट ब्रिटेन (1915) में और फेलिक्स डी' हेरेल ने फ्रांस (1917) में की थी। डी' हेरेल ने इस एजेंट की जीवाणुनाशक गतिविधि का वर्णन करने के लिए बैक्टीरियोफेज शब्द का प्रयोग किया, जिसका अर्थ है 'जीवाणु भक्षक'।
फ़ेज की संरचना बहुत सरल होती है, जिसमें केवल एक डीएनए (या कभी-कभी राइबोन्यूक्लिक एसिड (आरएनए)) अणु होता है जिसमें कई जीन होते हैं, जो प्रोटीन अणुओं से बने एक सुरक्षात्मक आवरण या कैप्सिड से घिरा होता है। 
वे दो जीवन चक्रों से गुजर सकते हैं:-
i. लयटिक चक्र 
ii. लाइसोजेनिक चक्र
जीवाणुभक्षी एक वाहक के रूप में:-
यह विदेशी डीएनए के बहुत बड़े टुकड़ों को स्वीकार कर सकता है। 
आनुवंशिक इंजीनियरों ने फ़ेज वैक्टर के कई व्युत्पन्न तैयार किए हैं जिनमें विभिन्न प्रकार के प्रतिबंध एंजाइमों के लिए केवल एक या दो स्थल होते हैं। 
> जिन फागे में स्टफर फ्रैगमेंट होता है, उन्हें सब्स्टिट्यूशन वेक्टर कहा जाता है क्योंकि उन्हें इस तरह से डिजाइन किया जाता है कि उनमें से एक टुकड़ा हटाया जा सके और उसकी जगह कुछ और लगाया जा सके। 
उदाहरण  :-  लैम्डा फेज, एम13 फेज, टी4, टी7 फेज, पी1 फेज आदि।
ए. एम13 फेज:- 
- बैक्टीरियोफेज एम13 को सर्वप्रथम म्यूनिख के अपशिष्ट जल से पृथक किया गया था (होफशनाइडर, 1963)। अतः इसका नाम एम13 फेज रखा गया। 
- यह एक तंतुमय फ़ेज है जिसमें 6407 न्यूक्लियोटाइड होते हैं। 
इसमें एकल-केन्द्रित वृत्ताकार डीएनए होता है। 
- इसे सैंगर ने 1982 में अनुक्रमित किया था।
- एम13 फेज का जीनोम:
एम13 को फेज वेक्टर के रूप में निर्मित करना:-
i. एम13 क्लोनिंग वेक्टर के निर्माण में पहला कदम इंटरजेनिक अनुक्रम में lacZ′ जीन को शामिल करना था। 
ii. इससे M13mp1 का निर्माण हुआ, जो X-gal अगर पर नीले रंग की पट्टिकाएँ बनाता है। 
iii. M13mp1 में lacZ′ जीन में कोई विशिष्ट प्रतिबंध स्थल नहीं है। 
iv. M13mp2 वेक्टर:- इसमें जीन के प्रारंभ के निकट हेक्सान्यूक्लियोटाइड GGATTC होता है। एक एकल न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन से यह GAATTC बन जाएगा, जो एक EcoRI साइट है। यह परिवर्तन इन विट्रो उत्परिवर्तन विधि द्वारा किया गया, जिसके परिणामस्वरूप M13mp2 प्राप्त हुआ। 
v. M13mp7 वेक्टर:- एक पॉलीलिंकर, जिसमें कई प्रतिबंध स्थल होते हैं और EcoRI चिपचिपे सिरे होते हैं। इस पॉलीलिंकर को M13mp2 के EcoRI स्थल में डाला गया, जिससे M13mp7 एक अधिक जटिल वेक्टर बन गया जिसमें चार संभावित क्लोनिंग स्थल (EcoRI, BamHI, SalI और PstI) हैं। पॉलीलिंकर को इस प्रकार डिज़ाइन किया गया है कि यह lacZ′ जीन को पूरी तरह से बाधित नहीं करता है। हालांकि इसमें बदलाव होता है, फिर भी b-गैलेक्टोसिडेज़ एंजाइम का उत्पादन होता है।
बी. पी1 फेज:-
 - P1 एक समशीतोष्ण जीवाणुभक्षी (फेज) है जो एस्चेरिचिया कोलाई और कुछ अन्य जीवाणुओं को संक्रमित करता है। 
 - जब फेज एक लाइसोजेनिक चक्र से गुजरता है, तो बैक्टीरिया में फेज जीनोम एक प्लास्मिड के रूप में मौजूद होता है। 
- अन्य फ़ेजों के विपरीत, यह मेजबान के डीएनए में एकीकृत हो जाता है। 
 - P1 में एक आइकोसाहेड्रल "सिर" होता है जिसमें डीएनए होता है, जो छह पूंछ तंतुओं वाली एक संकुचनशील पूंछ से जुड़ा होता है।
- P1 फेज का जीनोम मध्यम आकार का होता है, लगभग 93 किलोबैरिक पिन कोड (Kbp) लंबा। मेजबान में प्रवेश करने के बाद यह गोलाकार हो जाता है और प्लास्मिड के रूप में प्रतिकृति बनाता है। 
जीनोम में प्रतिकृति के दो उद्गम स्थल होते हैं, oriR जो लाइसोजेनिक चक्र के दौरान इसकी प्रतिकृति करता है और oriL जो लैटिक चरण के दौरान इसकी प्रतिकृति करता है।
- एक ऐसे बैक्टीरियोफेज पी1 क्लोनिंग सिस्टम का विकास करना जो 100 किलोबेस पेयर (केबीपी) जितने बड़े डीएनए खंडों को स्वीकार करने में सक्षम हो। 
- फ़ेज कणों में दो P1 loxP पुनर्संयोजन स्थल होते हैं जो पैक किए गए डीएनए को चक्रीयकृत करने के लिए होते हैं, जब इसे एस्चेरिचिया कोलाई के एक स्ट्रेन में इंजेक्ट किया जाता है जिसमें P1 Cre रिकॉम्बिनेज होता है, जो कि कैनामाइसिन प्रतिरोधी जीन है, ताकि चक्रीयकृत डीएनए वाले जीवाणु क्लोन का चयन किया जा सके। 
- P1 प्लास्मिड रेप्लिकॉन का उपयोग E. coli में प्रति कोशिका गुणसूत्र एक प्रति के रूप में उस DNA को स्थिर रूप से बनाए रखने के लिए किया जाता है, और एक lac प्रमोटर-नियंत्रित P1 लाइटिक रेप्लिकॉन का उपयोग DNA को पुनः पृथक करने से पहले उसे प्रवर्धित करने के लिए किया जाता है।
BAC (Bacterial Artificial Chromosome):-
> It was first developed by Shizuya in 1992.
> These are DNA constructs that are used for transformation and cloning in bacterial cells, mostly E.coli. Functional fertility plasmids or F-plasmids are used for the vector construction.
> The gene components included are rep6 for plasmid regulation, a selectable marker for antibiotic resistance, parA and parB for F-plasmid DNA, and T7 and Sp6 for transcription of inserted genes.
Features:-
- BAC vectors are DNA constructs that are used for cloning DNA in bacteria.
- These are simple plasmid which is designed to clone very large DNA fragments ranging in size from 75 to 300 kb.
- No chimerism seen.
- It is circular.
- Bacterial machinery does not have post-translational mechanism, hence the expression of eukaryotic proteins becomes difficult.
- 1-2 vectors are found per bacterial cell.
- More stable.
- Avantage:- The generation of BACs is quicker and more efficient, and also, it gives a better chromosome coverage map. Hence, today, BAC is preferred over YAC because they are more efficient.
- Applicable in modelling genetic diseases and human genome project.
BAC (बैक्टीरियल आर्टिफिशियल क्रोमोसोम):-
इसे सर्वप्रथम शिजुया ने 1992 में विकसित किया था।
ये डीएनए संरचनाएं हैं जिनका उपयोग जीवाणु कोशिकाओं, मुख्यतः ई. कोलाई में रूपांतरण और क्लोनिंग के लिए किया जाता है। कार्यात्मक उर्वरता प्लास्मिड या एफ-प्लास्मिड का उपयोग वेक्टर निर्माण के लिए किया जाता है।
इसमें शामिल जीन घटकों में प्लास्मिड विनियमन के लिए rep6, एंटीबायोटिक प्रतिरोध के लिए एक चयन योग्य मार्कर, F-प्लास्मिड डीएनए के लिए parA और parB, और सम्मिलित जीनों के प्रतिलेखन के लिए T7 और Sp6 शामिल हैं।
विशेषताएँ:-
- बीएसी वेक्टर डीएनए संरचनाएं हैं जिनका उपयोग बैक्टीरिया में डीएनए की क्लोनिंग के लिए किया जाता है।
- ये सरल प्लास्मिड हैं जिन्हें 75 से 300 केबी आकार के बहुत बड़े डीएनए खंडों को क्लोन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
- कोई काइमेरिज्म नहीं देखा गया।
- यह गोलाकार है।
- जीवाणु तंत्र में पोस्ट-ट्रांसलेशनल तंत्र नहीं होता है, इसलिए यूकेरियोटिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति मुश्किल हो जाती है।
प्रत्येक जीवाणु कोशिका में 1-2 वाहक पाए जाते हैं।
- और अधिक स्थिर।
लाभ  :-  बीएसी का निर्माण तेज़ और अधिक कुशल है, और साथ ही, यह बेहतर गुणसूत्र कवरेज मानचित्र प्रदान करता है। इसलिए, आज बीएसी को वाईएसी पर प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि वे अधिक कुशल हैं।
- आनुवंशिक रोगों के मॉडलिंग और मानव जीनोम परियोजना में लागू।
YAC (Yeast Artificial Chromosome):-
> It was first described in 1983 by Murray and Szostak.
> These are artificially constructed vectors. The system can undergo replication and has the capability to insert foreign DNA sequences.
> Components such as the autonomously replication system (ARS), centromere and telomeres are taken from the yeast Saccharomyces cerevisiae for the construction of vectors.
> The desired gene sequence can be inserted into these vectors and then put back into yeast; the yeast machinery cannot differentiate between their own and foreign genes; hence the foreign gene is also replicated.
Features:-
- YAC vectors are DNA constructs that are used for cloning DNA in yeasts.
- The amount of DNA that can be cloned into a YAC is, on average, from 200 to 500 kb. However, as much as 1 Mb can be cloned into a YAC.
- They often show chimerism. It contain DNA in a single clone from different locations in the genome. It is a problem encountered in constructing and using YAC libraries is that they typically contain clones that are chimeric.
- It is linear.
- Yeast machinery has post-translational mechanisms that are useful in the expression of eukaryotic proteins.
- Only one vector occurs per yeast cell.
- Less stable.
- The efficiency of cloning is low (about 1000 clones are obtained per microgram of vector and insert DNA).
- Advantage:- Many sequences that are unstable, underrepresented, or absent when cloned into prokaryotic systems, remain stable and intact in YAC clones.
- Disadvantage:- There are chances of gene deletion and gene recombination or inversion in the inserted gene sequence.
- Applicable in gene mapping and chromosome walking.
YAC (यीस्ट आर्टिफिशियल क्रोमोसोम):-
इसका सर्वप्रथम वर्णन 1983 में मरे और स्ज़ोस्टैक द्वारा किया गया था।
ये कृत्रिम रूप से निर्मित वेक्टर हैं। यह प्रणाली प्रतिकृति कर सकती है और इसमें बाहरी डीएनए अनुक्रमों को सम्मिलित करने की क्षमता है।
> सैकरोमाइसिस सेरेविसी नामक यीस्ट से स्वतः प्रतिकृति प्रणाली (एआरएस), सेंट्रोमियर और टेलोमियर जैसे घटक लेकर वैक्टर बनाए जाते हैं।
> वांछित जीन अनुक्रम को इन वैक्टरों में डाला जा सकता है और फिर वापस यीस्ट में डाल दिया जाता है; यीस्ट की कार्यप्रणाली अपने और बाहरी जीनों में अंतर नहीं कर पाती; इसलिए बाहरी जीन की भी प्रतिकृति हो जाती है।
विशेषताएँ:-
- YAC वेक्टर डीएनए संरचनाएं हैं जिनका उपयोग यीस्ट में डीएनए की क्लोनिंग के लिए किया जाता है।
वाईएसी में क्लोन किए जा सकने वाले डीएनए की मात्रा औसतन 200 से 500 किलोबाइट तक होती है। हालांकि, वाईएसी में 1 मेगाबाइट तक डीएनए क्लोन किया जा सकता है।
- इनमें अक्सर काइमेरिज्म पाया जाता है। इसमें जीनोम के विभिन्न स्थानों से डीएनए एक ही क्लोन में मौजूद होता है। वाईएसी लाइब्रेरी के निर्माण और उपयोग में आने वाली एक समस्या यह है कि इनमें आमतौर पर काइमेरिक क्लोन होते हैं।
- यह रैखिक है।
- यीस्ट तंत्र में ऐसे पोस्ट-ट्रांसलेशनल तंत्र होते हैं जो यूकेरियोटिक प्रोटीन की अभिव्यक्ति में उपयोगी होते हैं।
- खमीर की प्रत्येक कोशिका में केवल एक ही वाहक पाया जाता है।
- कम स्थिर।
- क्लोनिंग की दक्षता कम है (वेक्टर और इंसर्ट डीएनए के प्रति माइक्रोग्राम लगभग 1000 क्लोन प्राप्त होते हैं)।
-  लाभ:-  कई अनुक्रम जो प्रोकैरियोटिक प्रणालियों में क्लोन किए जाने पर अस्थिर, कम प्रतिनिधित्व वाले या अनुपस्थित होते हैं, वे YAC क्लोन में स्थिर और अक्षुण्ण रहते हैं।
-  हानि:-  सम्मिलित जीन अनुक्रम में जीन विलोपन और जीन पुनर्संयोजन या व्युत्क्रमण की संभावना होती है।
- जीन मैपिंग और क्रोमोसोम वॉकिंग में उपयोगी।

Agrobacterium mediated Gene Transfer:-

•  Agrobacterium is a gram -ve bacterium found in soil around plant roots.

•  Two species of Agrobacterium bacteria cause diseases in dicot plants:-

i. Agrobacterium tumefaciens

ii. Agrobacterium rhizogenes

i. Agrobacterium tumefaciens:- It causes Crown gall disease in angiosperm plants. Ti-plasmid is found in it.

ii. Agrobacterium rhizogenes:- It cause hairy root disease in angiosperm plants. Ri - plasmid is found in it.

•  Recombinant DNA is made by incorporating the desired gene into the T - DNA portion of the Ti plasmid. Which are transferred to Agrobacterium cell.

•  Now cut round pieces of sterilized leaf.

•  Now incubate these pieces with Agrobacterium overnight.

•  Now kept these pieces in Shooting medium for 2 days.

•  Now add Kanamycin and Carbenicillin in this shooting medium and cultured for 3-4 weeks.

•  Now transfer this to the rooting medium, add Kanamycin and Carbenicilin, culture it for 3-4 weeks.

•  Now establish this plant in a pot in green house.

•  After a few days, establish the plant in the soil of the field.

Mechanism of Gene Transfer:-

•  The T - DNA portion of the Ti - plasmid has the property that it can integrate into the plant's genome.

•  Leaf pieces release the Aceto - Syringine chemical that activates the Vir - Operon of T - DNA.

•  Once activated, the T-DNA portion separates from the plasmid and enters into many plant cells.

•  Now this T-DNA integrates into the genome by going into the nucleus.

•  This results in stable transformation of the plant.

एग्रोबैक्टीरियम द्वारा मध्यस्थता से जीन स्थानांतरण:-

•   एग्रोबैक्टीरियम एक ग्राम-ऋणात्मक जीवाणु है जो पौधों की जड़ों के आसपास की मिट्टी में पाया जाता है।

•   एग्रोबैक्टीरियम बैक्टीरिया की दो प्रजातियाँ द्विबीजपत्री पौधों में रोग उत्पन्न करती हैं:-

i. एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियंस 

ii. एग्रोबैक्टीरियम राइजोजेन्स 

i.  एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियंस :-  यह एंजियोस्पर्म पौधों में क्राउन गॉल रोग का कारण बनता है। इसमें टीआई-प्लास्मिड पाया जाता है।

ii.  एग्रोबैक्टीरियम राइजोजेन्स :-  यह एंजियोस्पर्म पौधों में रोएंदार जड़ रोग का कारण बनता है। इसमें Ri-प्लाज्मिड पाया जाता है।

•   वांछित जीन को Ti प्लास्मिड के T-DNA भाग में शामिल करके पुनर्संयोजित DNA बनाया जाता है। इन्हें एग्रोबैक्टीरियम कोशिका में स्थानांतरित किया जाता है।

•   अब रोगाणुरहित पत्तों के गोल टुकड़े काट लें।

•   अब इन टुकड़ों को एग्रोबैक्टीरियम के साथ रात भर इनक्यूबेट करें।

•   अब इन टुकड़ों को दो दिनों के लिए शूटिंग मीडियम में रखा गया।

•   अब इस शूटिंग मीडियम में कैनामाइसिन और कार्बेनिकिलिन मिलाएं और 3-4 सप्ताह तक कल्चर करें।

•   अब इसे रूटिंग मीडियम में स्थानांतरित करें, इसमें कैनामाइसिन और कार्बेनिसिलिन मिलाएं और इसे 3-4 सप्ताह तक कल्चर करें।

•   अब इस पौधे को ग्रीनहाउस में एक गमले में लगा दें।

•   कुछ दिनों बाद, पौधे को खेत की मिट्टी में लगा दें।

जीन स्थानांतरण की प्रक्रिया:-

•   टीआई-प्लास्मिड के टी-डीएनए भाग में यह गुण होता है कि यह पौधे के जीनोम में एकीकृत हो सकता है।

•   पत्ती के टुकड़े एसिटो-सिरिंगिन नामक रसायन छोड़ते हैं जो टी-डीएनए के विर-ऑपेरॉन को सक्रिय करता है।

•   सक्रिय होने के बाद, टी-डीएनए भाग प्लास्मिड से अलग हो जाता है और कई पादप कोशिकाओं में प्रवेश कर जाता है।

•   अब यह टी-डीएनए केंद्रक में जाकर जीनोम में एकीकृत हो जाता है।

•   इसके परिणामस्वरूप पौधे का स्थिर रूपांतरण होता है।

Herbicide resistance plants:-

Herbicide Tolerance or HT:-
Ø  Roundup herbicides have an active ingredient called glyphosate. This glyphosate is an inhibitor of an important enzyme that participates in amino acid synthesis in green plants.
Ø  Roundup ready crops have tolerance to Roundup herbicides. To develop these crops, a gene is introduced into their genome that makes an anti-glyphosate protein.
Example:- Roundup ready Soybean
Ø  Other Examples:-
i. Roundup ready sugar beet
ii. Roundup ready canola
iii. Roundup ready summer squash
iv. Roundup ready Alfalfa
v. Roundup ready cotton
vi. Roundup ready corn

Insect resistance plants:-

Insect Resistance:-

Cry gene transfer:- The cry gene is found in the plasmid of Bacillus thuringiensis (Bt) bacteria. This cry gene makes Crystal protein which is insecticidal.

Ø The cry gene was isolated from the plasmid of Bt and integrated into the cotton genome to form a transgenic plant called Bt-cotton.

Ø This Bt - cotton is resistant to boll worm.

Ø Crystal protein perforates the larva's alimentary canal leading to its death.

खरपतवारनाशक प्रतिरोधी पौधे:-

खरपतवारनाशक सहनशीलता या एचटी:-
राउंडअप   खरपतवारनाशकों में ग्लाइफोसेट नामक एक सक्रिय घटक होता है। यह ग्लाइफोसेट एक महत्वपूर्ण एंजाइम का अवरोधक है जो हरे पौधों में अमीनो एसिड संश्लेषण में भाग लेता है।
राउंडअप   प्रतिरोधी फसलों में राउंडअप खरपतवारनाशकों के प्रति सहनशीलता होती है। इन फसलों को विकसित करने के लिए, उनके जीनोम में एक जीन डाला जाता है जो ग्लाइफोसेट-रोधी प्रोटीन बनाता है।
उदाहरण :-  राउंडअप रेडी सोयाबीन
Ø   अन्य उदाहरण :-
i. राउंडअप रेडी शुगर बीट
ii. राउंडअप रेडी कैनोला
iii. राउंडअप रेडी समर स्क्वैश
iv. राउंडअप रेडी अल्फाल्फा
वी. राउंडअप रेडी कॉटन
vi. राउंडअप रेडी कॉर्न

कीट प्रतिरोधी पौधे:-

कीट  प्रतिरोधक क्षमता :-

क्राई  जीन  स्थानांतरण :-  क्राई जीन बैसिलस थुरिंगिएन्सिस (बीटी) बैक्टीरिया के प्लास्मिड में पाया जाता है। यह क्राई जीन क्रिस्टल प्रोटीन बनाता है जो कीटनाशक होता है।

Ø  क्राय जीन को बीटी के प्लास्मिड से अलग किया गया और कपास के जीनोम में एकीकृत करके बीटी-कपास नामक एक ट्रांसजेनिक पौधा बनाया गया।

यह  बीटी कपास बॉलवर्म के प्रति प्रतिरोधी है ।

Ø  क्रिस्टल प्रोटीन लार्वा की पाचन नली को छेद देता है जिससे उसकी मृत्यु हो जाती है।

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