2017 Solved Old Paper (BOT - 303D) New OK

Biotechnology Concepts:-

•      The term biotechnology was coined by Hungarian engineer Karl Ereky in 1919.

•      Biotechnology is a new term but this process has been used since ancient times. For example, wine, curd, vinegar, etc. have been produced by fermentation with the help of microorganisms.

•      After the discovery of RE (Restriction Endonuclease) in 1970, new methods of gene technology developed which were extremely beneficial for humans. This brought revolutionary changes in the field of Biotechnology.

•     Definition:- The branch of biology in which beneficial products are made for human beings by the controlled use of biological factors such as microorganisms or the components of cells is called biotechnology.

•   Old Biotechnology:- This type of biotechnology is based on the natural abilities of microbes. It has 2 main objectives -

i. Seeking new microbes with greater capabilities

ii. Improve the ability of micro organisms by selection, mutation etc.

•   New Biotechnology:- In this type of biotechnology, useful potential is developed artificially. like -

i. Recombinant DNA Technology

ii. Plant Tissue Culture

iii. Monoclonal Antibody Production

iv. Embryo Transfer in Animals

•   Historical Biotechnological Events:-

i. The use of yeast to make wine began around 6000 BC.

ii. The use of yeast to make bread began around 4000 BC.

iii. Sewage treatment started in 1910 with the use of microbes.

iv. Large scale production of acetone, glycerol and butanol began in 1912 with the use of bacteria.

v. Large scale production of penicillin began in 1944.

vi. Successful experiments in genetic engineering were carried out in 1973.

vii. In 1980, human foods obtained from fungi started trading in England.

viii. In 1983, the use of synthetic insulin in humans was permitted in the USA and England. This insulin was produced by bacteria which are obtained by genetic engineering.

Applications:-

1. Bio-control:- Weeds, diseases and pests are biologically controlled by the use of viruses, bacteria, fungi, etc. It does not cause any pollution in the environment.

2. Bio-fertilizers:- Rhizobium, BGA, Azolla etc. perform nitrogen fixation. They are being used in limited quantities. Azolla is widely used in paddy cultivation in Vietnam.

3. Embryo Culture:-

Ø  Inter specific which are difficult to survive, can be rescued by embryo culture.

Ø  Haploid plants are obtained from inter specific hybrids.

Ø  Micro-propagation of orchids is done.

4. Rapid clonal multiplication:- Fruits and flowers producing plants or wild plants are multiplied by meristem culture.

5. Disease free plants:-

Ø  Primarily useful for virus protection.

Ø  These are achieved through meristem culture and thermotherapy (incubation).

Ø  It is mainly useful in clonal crops.

6. Germplasm Conservation:-

Ø  The meristem, embryo and cells are stored in liquefied nitrogen at -196 ° C.

Ø  The meristem culture is kept in a slow growth state.

Ø It is particularly useful in clonal crops.

7. Isolation of homozygous lines:-

Ø  Homozygous lines can be obtained by chromosomal duplication of haploid plants derived from pollen culture.

Ø  In only two generations the homozygous lines are obtained.

Ø  In China, more than 24 improved varieties have been developed in paddy, wheat, barley, mustard etc.

8. Genetic Engineering:-

Ø  Remove the desired genes from other organisms and transfer them to plants.

Ø  We do this for the following features: -

i. Insect Resistance

ii. Virus Resistance

iii. Weedicide Resistance

Ø  This is a revolutionary change in crop improvement.

Scope of Biotechnology:- Job opportunities in different sectors:- - Healthcare - Medicine - Medical Sciences - Pharmaceuticals - Agriculture - Animal husbandry - Genetic Engineering Different posts in different sectors:- - Forensic Science Technicians - Medical Scientists - Microbiologists - Environmental Biotechnologist - Geneticist - Molecular Biotechnologist - Biochemist - Medical Technician and Clinical Lab Technologist - Pharmaceutical Biotechnologist

जैव प्रौद्योगिकी अवधारणाएँ:-

•       जैव प्रौद्योगिकी शब्द का प्रयोग 1919 में हंगेरियन इंजीनियर कार्ल एरेकी ने किया था।

•       जैव प्रौद्योगिकी एक नया शब्द है, लेकिन इस प्रक्रिया का उपयोग प्राचीन काल से होता आ रहा है। उदाहरण के लिए, शराब, दही, सिरका आदि का उत्पादन सूक्ष्मजीवों की सहायता से किण्वन द्वारा किया जाता रहा है।

•       1970 में RE (प्रतिबंध एंडोन्यूक्लीज)  की खोज के बाद , जीन प्रौद्योगिकी की नई विधियाँ विकसित हुईं जो मनुष्यों के लिए अत्यंत लाभकारी थीं। इससे जैव प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में क्रांतिकारी परिवर्तन आए।

•      परिभाषा :-  जीव विज्ञान की वह शाखा जिसमें सूक्ष्मजीवों या कोशिकाओं के घटकों जैसे जैविक कारकों के नियंत्रित उपयोग द्वारा मनुष्यों के लिए लाभकारी उत्पाद बनाए जाते हैं, जैव प्रौद्योगिकी कहलाती है।

•    पुरानी जैव प्रौद्योगिकी:-  इस प्रकार की जैव प्रौद्योगिकी सूक्ष्मजीवों की प्राकृतिक क्षमताओं पर आधारित है। इसके दो मुख्य उद्देश्य हैं -

i.  अधिक क्षमताओं वाले नए सूक्ष्मजीवों की खोज करना

ii.  चयन, उत्परिवर्तन आदि द्वारा सूक्ष्मजीवों की क्षमता में सुधार करना।

•    नई जैव प्रौद्योगिकी:-  इस प्रकार की जैव प्रौद्योगिकी में, उपयोगी क्षमता को कृत्रिम रूप से विकसित किया जाता है। जैसे -

i. पुनर्संयोजित डीएनए प्रौद्योगिकी

ii. पादप ऊतक संवर्धन

iii.  मोनोक्लोनल एंटीबॉडी उत्पादन

iv. पशुओं में भ्रूण स्थानांतरण

•    ऐतिहासिक जैव प्रौद्योगिकी संबंधी घटनाएँ:-

i.  शराब बनाने के लिए खमीर का उपयोग लगभग 6000 ईसा पूर्व शुरू हुआ।

ii.  रोटी बनाने में खमीर का उपयोग लगभग 4000 ईसा पूर्व शुरू हुआ।

iii.  सूक्ष्मजीवों के उपयोग से 1910 में सीवेज उपचार शुरू हुआ।

iv.  एसीटोन, ग्लिसरॉल और ब्यूटेनॉल का बड़े पैमाने पर उत्पादन 1912 में बैक्टीरिया के उपयोग से शुरू हुआ।

v.  पेनिसिलिन का बड़े पैमाने पर उत्पादन 1944 में शुरू हुआ।

vi.  आनुवंशिक अभियांत्रिकी के क्षेत्र में सफल प्रयोग 1973 में किए गए।

vii.  1980 में, कवक से प्राप्त मानव खाद्य पदार्थों का इंग्लैंड में व्यापार शुरू हुआ।

viii.  1983 में, अमेरिका और इंग्लैंड में मनुष्यों में कृत्रिम इंसुलिन के उपयोग की अनुमति दी गई थी। यह इंसुलिन बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित किया गया था, जिसे आनुवंशिक इंजीनियरिंग द्वारा प्राप्त किया गया था।

आवेदन:-

1.  जैविक नियंत्रण :- खरपतवार, रोग और कीटों को विषाणुओं, जीवाणुओं, कवक आदि के उपयोग से जैविक रूप से नियंत्रित किया जाता है। इससे पर्यावरण में कोई प्रदूषण नहीं होता है।

2.  जैविक उर्वरक :- राइजोबियम, बीजानोलोजी, अजोला आदि नाइट्रोजन स्थिरीकरण करते हैं। इनका उपयोग सीमित मात्रा में किया जा रहा है। वियतनाम में धान की खेती में अजोला का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।

3.  भ्रूण संवर्धन :-

Ø   अंतर-प्रजातिगत जीव जो जीवित रहने में मुश्किल होते हैं, उन्हें भ्रूण संवर्धन द्वारा बचाया जा सकता है।

Ø   अगुणित पौधे अंतर-प्रजाति संकरों से प्राप्त किए जाते हैं।

Ø   ऑर्किड का सूक्ष्म प्रसार किया जाता है।

4.  तीव्र क्लोनल गुणन :- फल और फूल उत्पन्न करने वाले पौधों या जंगली पौधों कोमेरिस्टेम संवर्धन द्वारा गुणा किया जाता है।

5.  रोगमुक्त पौधे :-

Ø   मुख्य रूप से वायरस से सुरक्षा के लिए उपयोगी।

ये   प्रक्रिया मेरिस्टेम संवर्धन और थर्मोथेरेपी (ऊष्मायन) के माध्यम से प्राप्त की जाती है।

Ø   यह मुख्य रूप से क्लोनल फसलों में उपयोगी है।

6.  जर्मप्लाज्म संरक्षण :-

  मेरिस्टेम, भ्रूण और कोशिकाओं को -196 डिग्री सेल्सियस पर द्रवीकृत नाइट्रोजन में संग्रहित किया जाता है ।

  मेरिस्टेम कल्चर को धीमी वृद्धि की अवस्था में रखा जाता है ।

Ø यह क्लोनल फसलों में विशेष रूप से उपयोगी है। 

7.  समरूप वंशानुक्रमों का पृथक्करण :-

  पराग संवर्धन से प्राप्त अगुणित पौधों के गुणसूत्रों के दोहराव द्वारा समयुग्मजी वंश प्राप्त किए जा सकते हैं ।

Ø   केवल दो पीढ़ियों में ही समयुग्मजी वंश प्राप्त हो जाते हैं।

चीन   में धान, गेहूं, जौ, सरसों आदि की 24 से अधिक उन्नत किस्में विकसित की गई हैं।

8.  आनुवंशिक अभियांत्रिकी :-

Ø   अन्य जीवों से वांछित जीन निकालकर उन्हें पौधों में स्थानांतरित करें।

हम   निम्नलिखित विशेषताओं के लिए ऐसा करते हैं:

i.  कीट प्रतिरोधक क्षमता

ii.  वायरस प्रतिरोध

iii.  खरपतवारनाशक प्रतिरोध

Ø   फसल सुधार के क्षेत्र में यह एक क्रांतिकारी बदलाव है।

जैव प्रौद्योगिकी का दायरा:- विभिन्न क्षेत्रों में रोजगार के अवसर:- - स्वास्थ्य देखभाल - दवा - चिकित्सा विज्ञान - फार्मास्यूटिकल्स - कृषि - पशुपालन - जेनेटिक इंजीनियरिंग विभिन्न क्षेत्रों में विभिन्न पद:- - फोरेंसिक विज्ञान तकनीशियन - चिकित्सा वैज्ञानिक - सूक्ष्मजीवविज्ञानी - पर्यावरण जैव प्रौद्योगिकीविद् - आनुवंशिकीविद् - आणविक जैव प्रौद्योगिकीविद् - जैव रसायनज्ञ - मेडिकल तकनीशियन और क्लिनिकल लैब टेक्नोलॉजिस्ट - फार्मास्युटिकल बायोटेक्नोलॉजिस्ट

माध्यम व कर्तोतक का स्थानांतरण (Transfer Technique):-

•      इनके लिए LAF केबिनेट का उपयोग किया जाता है। [LAF = Laminar Air Flow]

(The LAF cabinet is used for this step.)

•      LAF में पहले 15 मिनट तक UV प्रकाश द्वारा आंतरिक वातावरण को निर्जमित किया जाता है।

(In LAF first of all the internal environment is sterilised by UV light for 15 minutes.)

•      LAF में हवा HEPA फिल्टर से होकर उपयोगकर्ता की ओर बहती है।

(The air in the LAF flows through the HEPA filter to the user.)

[HEPA = High Efficiency Particulate Air]

•      HEPA फिल्टर का छिद्र आकार 0.3µm होता है जिसमें से 99.97% वायुजनित कण नहीं गुजर सकते।

(The pore size of HEPA filter is 0.3µm through which 99.97% of airborne particles cannot pass out.)

•      Pouring:- माध्यम को ऑटोक्लेव से निकालकर LAF केबिनेट में लाते हैं। अब माध्यम को संवर्धन पात्र में डालते हैं जिनमें कर्तोतक का संवर्धन करना होता है। इसे Pouring कहते हैं।

(The medium is removed from the autoclave and brought to the LAF cabinet. Now, we pour the medium in the culture vessel, in which the explant is to be cultured. This is called Pouring.)

•      Inoculation:- जब माध्यम ठंडा होकर जम जाता है तो LAF केबिनेट में कर्तोतक को संवर्धन पात्र में माध्यम पर स्थानांतरित करते हैं। इसे Inoculation कहते हैं।

(When the medium cools and freezes, the explants are transfered on to the medium in the culture vessel. This is called Inoculation.)

The phenomenon of morphogenesis:-

Introduction:- Biological organization of any life coordinated with several events as though a craftsman was moulding it according to a plan. In this process, the individual parts do not develop independently but all are knit together into an organised system. The biological science concerned with this dynamic and casual aspect of organic form is called "Morphogenesis".

> The derivation of this word is obvious, the origin of form. It attempts to expose the effects of

various factors and how these factors manifest an organic form in toto. "Morphogenesis", a

distinctive aspect of organization of life, is the crossroad where all the highways of biological

exploration tend to converge", says Sinnott.

> More studies have been made to understand morphogenetic problems of animals rather

than plants. Recent developments in plant cells, tissues and organs of higher plants in

culture, are making the science of plant morphogenesis a fruitful one. 

आकारिकी की घटना:-

परिचय:-  किसी भी जीव का जैविक संगठन कई घटनाओं के समन्वय से होता है, मानो कोई शिल्पकार उसे एक योजना के अनुसार आकार दे रहा हो। इस प्रक्रिया में, अलग-अलग भाग स्वतंत्र रूप से विकसित नहीं होते, बल्कि सभी एक संगठित प्रणाली में आपस में जुड़े होते हैं। जीव विज्ञान का वह भाग जो जैविक संरचना के इस गतिशील और आकस्मिक पहलू से संबंधित है, उसे "मॉर्फोजेनेसिस" कहा जाता है।

इस शब्द की व्युत्पत्ति स्पष्ट है, रूप की उत्पत्ति। यह इसके प्रभावों को उजागर करने का प्रयास करता है।

विभिन्न कारक और ये कारक किस प्रकार एक जैविक रूप को पूर्ण रूप से प्रकट करते हैं। "मॉर्फोजेनेसिस", एक

जीवन के संगठन का विशिष्ट पहलू वह चौराहा है जहाँ जैविक मार्ग के सभी राजमार्ग मिलते हैं।

सिनोट कहते हैं, "अन्वेषणों में अभिसरण की प्रवृत्ति होती है।"

जानवरों की आकारिकी संबंधी समस्याओं को समझने के लिए अधिक अध्ययन किए गए हैं।

पौधों की तुलना में। उच्च पौधों की कोशिकाओं, ऊतकों और अंगों में हाल के विकास।

संस्कृति के क्षेत्र में काम करने वाले लोग पादप आकारिकी के विज्ञान को एक फलदायी विज्ञान बना रहे हैं। 

Autoclave (ऑटोक्लेव):- An autoclave is a laboratory and medical device used to sterilize equipment, culture media, glassware, surgical instruments, and other materials using steam under pressure.

(ऑटोक्लेव एक प्रयोगशाला और चिकित्सा उपकरण है जिसका उपयोग दबाव में भाप का उपयोग करके उपकरण, कल्चर मीडिया, कांच के बर्तन, शल्य चिकित्सा उपकरण और अन्य सामग्रियों को कीटाणुरहित करने के लिए किया जाता है।)

Principle of Autoclave (ऑटोक्लेव का सिद्धांत):-

> The autoclave works on the principle that water boils at a higher temperature when pressure increases.

(ऑटोक्लेव इस सिद्धांत पर काम करता है कि दबाव बढ़ने पर पानी अधिक तापमान पर उबलता है।)

- At normal pressure → water boils at 100°C

(सामान्य दबाव पर → पानी 100°C पर उबलता है)

- At 15 psi pressure → steam reaches 121°C

(15 psi दबाव पर → भाप 121°C तक पहुँच जाती है)

> Steam at high temperature penetrates materials and kills microorganisms and spores by protein coagulation and enzyme denaturation.

(उच्च तापमान वाली भाप सामग्रियों में प्रवेश करती है और प्रोटीन के जमाव और एंजाइम के विकृतीकरण द्वारा सूक्ष्मजीवों और बीजाणुओं को नष्ट कर देती है।)

> Moist heat is more effective than dry heat because steam transfers heat faster and penetrates deeply.

(नम ऊष्मा शुष्क ऊष्मा से अधिक प्रभावी होती है क्योंकि भाप ऊष्मा को तेजी से स्थानांतरित करती है और गहराई तक प्रवेश करती है।)

Micro propagation (सूक्ष्म प्रवर्धन):-

·         परिभाषा (Definition):- पादप के कायिक भाग को कर्तोतक के समान उपयोग करके निर्जमित परिस्थितियों में कृत्रिम माध्यम पर संवर्धन करने की प्रक्रिया को सूक्ष्म प्रवर्धन कहते हैं। अर्थात क्लोनीय प्रवर्धन की कृत्रिम   विधि को सूक्ष्म प्रवर्धन कहते हैं।

(The process of culturing the vegetative part of the plant as explant on culture medium under sterilized conditions is called micro propagation. That is, the artificial method of clonal propagation is called micro propagation.)

·         क्लोन शब्द का प्रयोग सबसे पहले Weber ने किया था।

(The term clone was first used by Weber.)

·         सूक्ष्म प्रवर्धन में बहुत कम जगह और बहुत कम समय में एक पौधे से बहुत अधिक संख्या में सूक्ष्म कायिक प्ररोह बना लिए जाते हैं।

(Very large number of minute vegetative shoots are produced from a plant in very little space and in a very short time in micro propagation.)

·         सूक्ष्म प्रवर्धन के लिए ऊतक संवर्धन का उपयोग G. Morel ने 1960 में शुरू किया था। उसने ओर्किड   प्रवर्धन के लिए इसका उपयोग किया था।

(The use of tissue culture for micro-propagation started in 1960 by G. Morel. He used it for orchid propagation.)

Commercial feasibility and advantages of micro propagation:-

Commercial Feasibility:-

1. Market Scenario:-

> Demand for tissue cultured plantlets is growing rapidly. India, with its low cost skilled labour as well as scientific manpower (both of which are essential for tissue culture) has a natural advantage. Additional favourable factors are the wide range of plant biodiversity in the country and favorable tropical climate (which enables greenhouses with low energy consumption).

> The potential for the domestic market is enormous and by conservative estimates it is around Rs. 200 crores with an annual growth rate of 20%. There are more than 70 established commercial tissue culture units. Their production capacity ranges between 0.5 million to 10 million plants per annum with an aggregate production capacity of about 200 million plantlets per year.

> The protocols have either been developed in-house or transferred through the various research institutions and universities engaged in development of the protocols through support of the Department of Biotechnology (DBT) Currently, the focus of the companies is mainly banana, floriculture,

sugarcane and potato.

> With increasing awareness about the advantages of tissue culture raised plants in improving yield and quality, their domestic consumption is also increasing optimistically. The major consumers of tissue culture raised plants are the State Agriculture Department, Agri Export Zones (AEZs), State agencies such as Spice Board, sugar industry and private farmers. The paper industry, medicinal plant industry and State Forest Departments are using tissue culture raised plants in a limited scale. Also a number of progressive farmers and nurseries in the states are the major consumers of Tissue culture plants particularly for flowers, banana, sugarcane and medicinal plants.

2. Establishment of Commercial Plant Tissue Culture Unit:- Commercial plant tissue culture unit consists of the following components:

a. Storage room for chemicals:- It is advisable to have a separate area for storage of chemicals, apparatus and equipments. Chemicals required in small amounts should not be purchased in large quantities as they may lose their activity, pick up moisture or get contaminated. Such problems can be

overcome by purchasing small lots on a regular basis.

b. Washing and Media Preparation Room:- 

> The glassware washing area should be located near the sterilization room. This area should have at least one large sink but two sinks are preferable with running tap water. Adequate workspace is required on each sides of the sink; this space is used for glassware soaking and drainage. Plastic netting can be placed on surfaces near the sink to reduce glassware breakage and enhance water drainage. The outlet

pipe from the sink should be of PVC to resist damage from acids and alkalis. Both hot and cold water should be available and the water still and de-ionisation unit should be located nearby. The washing room should be swapped periodically. Mobile drying racks can be used and lined with cheesecloth to prevent water dripping and loss of small objects. 

> Ovens or hot air-cabinets should be located close to the glassware washing and storage area. Dust-proof cabinets and storage containers should be installed to allow for easy access to glassware. When culture vessels are removed from the growth area, they are often autoclaved to kill contaminants and to soften semi-solid media. It should be possible to move the vessels easily to the washing area. The glassware storage area should be close to the wash area to expedite storage and access for media preparation.

> The media preparation room should have smooth walls and floors, which enable easy cleaning to maintain a high degree of cleanliness.

> Minimum number of doors and windows should be provided in this room but within the local fire safety regulations. Media preparation area should be equipped with both tap and purified water. An appropriate system for water purification must be selected and fitted after careful consideration of the cost and quality. A number of electrical appliances are required for media preparation; hence, it is essential to have safety devices like fire extinguisher, fire blanket and a first aid kit in the media preparation room. A variety of glassware, plastic ware and stainless steel apparatus is required for measuring, mixing, and media storage. These should be stored in the cabinets built under the worktables and taken out for use as and when required. 

> The water source and glassware storage area should be in or near the media preparation area. The workbench tops should be made with plastic laminate surfaces that can tolerate frequent cleaning. Media storage room should have capacity to storage the media for at least 7 days. Sterility Class

1,00,000 is desirable for media storage room. 

c. Inoculation Room:-

> The most important work area is the Inoculation room where the core activity takes place. The transfer area needs to be as clean as possible with minimal air disturbance. Walls and floors of the Inoculation room must be smooth to ensure frequent cleaning. The doors and windows should be minimal to prevent contamination, but within local safety code. There is no special lighting requirement in the transfer room. The illumination of the laminar airflow chamber is sufficient for work.

> Sterilization of the instruments can be done with glass-bead sterilizers or flaming after dipping in alcohol, usually ethanol. The culture containers should be stacked on mobile carts (trolleys) to facilitate easy movement from the medium storage room to the transfer room, and finally to the culture room. Fire extinguishers and first aid kits should be provided in the transfer room as a safety measure. Special laboratory shoes and coats should be worn in this area. Ultraviolet (UV) lights are sometimes installed in transfer areas to disinfect the room; these lights should be used only when people and plant material are not in the room. Sterility Class 1,00,000 is desirable for inoculation room which can be achieved through installation of pressurized air module or air handling unit.

d. Growth Room:- 

> Culture room is an equally important area where plant cultures are maintained under controlled environmental conditions to achieve optimal growth. It is advisable to have more than one growth room to provide varied culture conditions since different plant species may have different requirements of light and temperature during in vitro culture.

> Also, in the event of the failure of cooling or lighting in one room, the plant cultures can be moved to another room to prevent loss of cultures. In the growth room, the number of doors should be minimal to prevent contamination. The culture containers can be placed on either fixed or mobile shelves. Mobile shelves have the advantage of providing access to cultures from both sides of the shelves. The height of the shelves should not exceed 2m.

> The primary source of illumination in the growth room is normally from the lights mounted on the shelves. Overhead light sources can be minimized, as they would be in use only while working during the dark cycle. Plant cultures may not receive uniform light from the conventional downward illumination. Lights directly fitted to the racks create uneven heat distribution. Sideways illumination is an alternative, which requires less number of lights, and provides more uniform lighting. But care has to be taken not to break the lights while moving the cultures across the shelves. Sterility Class 1,00,000 is desirable for growth room.

Advantages of Micro-propagation:- Micro-propagation has several advantages over conventional methods of propagation such as:

1. Rapid multiplication:- Micro-propagation offers rapid multiplication of desired plant speceis.

2. Requirement of only limited number of explants:-  Small pieces of plant (explants)/tissue can be used to produce a large number of plants in a relatively small space.

3. Uniform or true to type plants:- Micro-propagation provides a high degree of phenotypic/physical uniformity. Since the production cycle takes place under controlled conditions, proper planning and scheduling based on the market demand is possible. The resulting product has very high degree of uniformity compared with traditionally propagated plants.

4. Germplasm storage:- Plants can be stored in vitro in a small space and less labour is required for maintenance of stock plants.

5. Disease free planting material:- Plantlets produced by tissue culture are usually disease free. With proper diagnosis and treatments, elimination of fungus, bacteria and virus prior to large scale propagation is possible. With the help of seroloical and molecular technique it is possible to index virus of mother plant/explant which is to be used for mass multiplication. 

6. Growth manipulation:- Nutrient levels, light, temperature and other factors can be more effectively controlled to manipulate the growth, multiplication and regeneration.

7. Round the year production:- Micro-propagation is independent of season. As micro - propagation could be carried out throughout the year; production cycle can be scheduled to meet peak demands.

8. Rapid propagation is possible:- For species that have long generation time, low levels of seed production, or seeds that do not readily germinate, rapid propagation is possible through tissue culture.

9. No need to wait:- The time required is much shortened, no need to wait for the whole life cycle of seed development.

सूक्ष्म प्रसार की व्यावसायिक व्यवहार्यता और लाभ:-

व्यावसायिक व्यवहार्यता:-

1. बाजार परिदृश्य:-

ऊतक संवर्धन द्वारा तैयार पौधों की मांग तेजी से बढ़ रही है। भारत में कुशल श्रम और वैज्ञानिक क्षमता (जो ऊतक संवर्धन के लिए आवश्यक हैं) की कम लागत के कारण स्वाभाविक लाभ है। इसके अतिरिक्त, देश में पौधों की व्यापक जैव विविधता और अनुकूल उष्णकटिबंधीय जलवायु (जो कम ऊर्जा खपत वाले ग्रीनहाउस को संभव बनाती है) भी सहायक कारक हैं।

घरेलू बाजार में अपार संभावनाएं हैं और अनुमानतः यह लगभग 200 करोड़ रुपये का है, जिसकी वार्षिक वृद्धि दर 20% है। यहां 70 से अधिक स्थापित वाणिज्यिक ऊतक संवर्धन इकाइयां हैं। इनकी उत्पादन क्षमता प्रति वर्ष 0.5 मिलियन से 10 मिलियन पौधों के बीच है, और कुल उत्पादन क्षमता लगभग 200 मिलियन पौधे प्रति वर्ष है।

प्रोटोकॉल या तो कंपनी के भीतर ही विकसित किए गए हैं या जैव प्रौद्योगिकी विभाग (डीबीटी) के सहयोग से प्रोटोकॉल विकास में लगे विभिन्न अनुसंधान संस्थानों और विश्वविद्यालयों के माध्यम से स्थानांतरित किए गए हैं। वर्तमान में, कंपनियों का मुख्य ध्यान केले और पुष्पकृषि पर है।

गन्ना और आलू।

टिशू कल्चर से उगाए गए पौधों की पैदावार और गुणवत्ता में सुधार के फायदों के बारे में बढ़ती जागरूकता के साथ, घरेलू स्तर पर भी इनकी खपत में आशाजनक वृद्धि हो रही है। टिशू कल्चर से उगाए गए पौधों के प्रमुख उपभोक्ता राज्य कृषि विभाग, कृषि निर्यात क्षेत्र (एईजेड), मसाला बोर्ड जैसी राज्य एजेंसियां, चीनी उद्योग और निजी किसान हैं। कागज उद्योग, औषधीय पौध उद्योग और राज्य वन विभाग सीमित मात्रा में टिशू कल्चर से उगाए गए पौधों का उपयोग कर रहे हैं। इसके अलावा, राज्यों में कई प्रगतिशील किसान और नर्सरियां टिशू कल्चर से उगाए गए पौधों, विशेष रूप से फूलों, केले, गन्ने और औषधीय पौधों के प्रमुख उपभोक्ता हैं।

2. वाणिज्यिक पादप ऊतक संवर्धन इकाई की स्थापना:-  वाणिज्यिक पादप ऊतक संवर्धन इकाई में निम्नलिखित घटक शामिल हैं:

क. रसायनों का भंडारण कक्ष:-  रसायनों, उपकरणों और साज-सामान के भंडारण के लिए एक अलग स्थान होना उचित है। कम मात्रा में आवश्यक रसायनों को अधिक मात्रा में नहीं खरीदना चाहिए क्योंकि इससे उनकी सक्रियता कम हो सकती है, उनमें नमी आ सकती है या वे दूषित हो सकते हैं। इस प्रकार की समस्याओं से बचा जा सकता है।

नियमित रूप से छोटी-छोटी मात्रा में सामान खरीदकर इस समस्या पर काबू पाया जा सकता है।

ख. धुलाई और मीडिया तैयारी कक्ष:- 

कांच के बर्तनों को धोने का स्थान नसबंदी कक्ष के पास होना चाहिए। इस क्षेत्र में कम से कम एक बड़ा सिंक होना चाहिए, लेकिन नल के पानी की सुविधा वाले दो सिंक बेहतर रहेंगे। सिंक के दोनों ओर पर्याप्त कार्यक्षेत्र होना आवश्यक है; इस स्थान का उपयोग कांच के बर्तनों को भिगोने और पानी निकालने के लिए किया जाता है। कांच के बर्तनों के टूटने को कम करने और पानी की निकासी को बेहतर बनाने के लिए सिंक के पास की सतहों पर प्लास्टिक की जाली लगाई जा सकती है।

सिंक से निकलने वाला पाइप पीवीसी का होना चाहिए ताकि अम्ल और क्षार से होने वाले नुकसान से सुरक्षित रहे। गर्म और ठंडा पानी उपलब्ध होना चाहिए और पानी को स्थिर करने और डी-आयोनाइज़ेशन यूनिट पास में ही स्थित होनी चाहिए। कपड़े धोने का कमरा समय-समय पर बदला जाना चाहिए। पानी टपकने और छोटी वस्तुओं के खोने से बचाने के लिए पोर्टेबल सुखाने वाले रैक का उपयोग किया जा सकता है और उन्हें मलमल के कपड़े से ढका जा सकता है। 

कांच के बर्तनों को धोने और रखने के क्षेत्र के पास ही ओवन या गर्म हवा वाले कैबिनेट होने चाहिए। कांच के बर्तनों तक आसानी से पहुँचने के लिए धूल-रोधी कैबिनेट और भंडारण कंटेनर लगाए जाने चाहिए। जब ​​संवर्धन पात्रों को वृद्धि क्षेत्र से हटाया जाता है, तो संदूषकों को नष्ट करने और अर्ध-ठोस माध्यम को नरम करने के लिए उन्हें अक्सर ऑटोक्लेव किया जाता है। पात्रों को धोने के क्षेत्र में आसानी से ले जाने की सुविधा होनी चाहिए। माध्यम तैयार करने के लिए भंडारण और पहुँच को आसान बनाने के लिए कांच के बर्तनों का भंडारण क्षेत्र धोने के क्षेत्र के पास होना चाहिए।

मीडिया तैयार करने वाले कमरे की दीवारें और फर्श चिकने होने चाहिए, जिससे उच्च स्तर की स्वच्छता बनाए रखने के लिए सफाई करना आसान हो।

इस कमरे में न्यूनतम संख्या में दरवाजे और खिड़कियां होनी चाहिए, लेकिन स्थानीय अग्नि सुरक्षा नियमों का पालन करते हुए। मीडिया तैयार करने वाले क्षेत्र में नल और शुद्ध पानी दोनों की व्यवस्था होनी चाहिए। जल शोधन प्रणाली का चयन और स्थापना लागत और गुणवत्ता को ध्यान में रखते हुए सावधानीपूर्वक की जानी चाहिए। मीडिया तैयार करने के लिए कई विद्युत उपकरणों की आवश्यकता होती है; इसलिए, मीडिया तैयार करने वाले कमरे में अग्निशामक यंत्र, फायर ब्लैंकेट और प्राथमिक चिकित्सा किट जैसे सुरक्षा उपकरण होना आवश्यक है। मापने, मिलाने और मीडिया भंडारण के लिए विभिन्न प्रकार के कांच के बर्तन, प्लास्टिक के बर्तन और स्टेनलेस स्टील के उपकरण आवश्यक हैं। इन्हें वर्कटेबल के नीचे बने कैबिनेट में रखा जाना चाहिए और आवश्यकतानुसार निकाला जाना चाहिए। 

> जल स्रोत और कांच के बर्तनों का भंडारण क्षेत्र मीडिया तैयार करने वाले क्षेत्र में या उसके पास होना चाहिए। वर्कबेंच के ऊपरी भाग प्लास्टिक लैमिनेट सतहों से बने होने चाहिए जो बार-बार सफाई सहन कर सकें। मीडिया भंडारण कक्ष में कम से कम 7 दिनों तक मीडिया को संग्रहित करने की क्षमता होनी चाहिए। रोगाणुहीनता वर्ग

मीडिया स्टोरेज रूम के लिए 1,00,000 की क्षमता वांछनीय है। 

सी. टीकाकरण कक्ष:-

सबसे महत्वपूर्ण कार्यक्षेत्र टीकाकरण कक्ष है, जहाँ मुख्य कार्य संपन्न होता है। स्थानांतरण क्षेत्र यथासंभव स्वच्छ होना चाहिए और वायु का प्रवाह न्यूनतम होना चाहिए। टीकाकरण कक्ष की दीवारें और फर्श चिकने होने चाहिए ताकि बार-बार सफाई की जा सके। संक्रमण से बचाव के लिए दरवाजे और खिड़कियाँ न्यूनतम होनी चाहिए, लेकिन स्थानीय सुरक्षा नियमों के अनुरूप होनी चाहिए। स्थानांतरण कक्ष में प्रकाश व्यवस्था की कोई विशेष आवश्यकता नहीं है। लैमिनर एयरफ्लो कक्ष की रोशनी कार्य के लिए पर्याप्त है।

उपकरणों को कांच के मनकों वाले स्टेरिलाइज़र से या अल्कोहल, आमतौर पर इथेनॉल में डुबोकर आग से कीटाणुरहित किया जा सकता है। कल्चर कंटेनरों को मोबाइल कार्ट (ट्रॉली) पर रखा जाना चाहिए ताकि मीडियम स्टोरेज रूम से ट्रांसफर रूम और अंत में कल्चर रूम तक आसानी से ले जाया जा सके। सुरक्षा उपाय के तौर पर ट्रांसफर रूम में अग्निशामक यंत्र और प्राथमिक चिकित्सा किट उपलब्ध कराई जानी चाहिए। इस क्षेत्र में विशेष प्रयोगशाला जूते और कोट पहनना अनिवार्य है। कभी-कभी कमरे को कीटाणुरहित करने के लिए ट्रांसफर क्षेत्रों में पराबैंगनी (यूवी) लाइटें लगाई जाती हैं; इन लाइटों का उपयोग केवल तभी किया जाना चाहिए जब कमरे में लोग और पौधे की सामग्री मौजूद न हो। इनोक्यूलेशन रूम के लिए स्टेरिलिटी क्लास 1,00,000 वांछनीय है, जिसे प्रेशराइज्ड एयर मॉड्यूल या एयर हैंडलिंग यूनिट लगाकर प्राप्त किया जा सकता है।

डी. ग्रोथ रूम:- 

संवर्धन कक्ष एक समान रूप से महत्वपूर्ण क्षेत्र है जहाँ इष्टतम वृद्धि प्राप्त करने के लिए नियंत्रित पर्यावरणीय परिस्थितियों में पादप संवर्धन किया जाता है। विभिन्न संवर्धन परिस्थितियाँ प्रदान करने के लिए एक से अधिक संवर्धन कक्ष रखना उचित है, क्योंकि विभिन्न पादप प्रजातियों की इन विट्रो संवर्धन के दौरान प्रकाश और तापमान की आवश्यकताएँ भिन्न हो सकती हैं।

इसके अलावा, यदि किसी कमरे में शीतलन या प्रकाश व्यवस्था विफल हो जाती है, तो पौधों को दूसरे कमरे में स्थानांतरित किया जा सकता है ताकि उनका नुकसान न हो। वृद्धि कक्ष में संदूषण से बचाव के लिए दरवाजों की संख्या न्यूनतम होनी चाहिए। संवर्धन कंटेनरों को स्थिर या चल अलमारियों पर रखा जा सकता है। चल अलमारियों का लाभ यह है कि अलमारियों के दोनों ओर से संवर्धन तक पहुंच प्रदान की जा सकती है। अलमारियों की ऊंचाई 2 मीटर से अधिक नहीं होनी चाहिए।

वृद्धि कक्ष में प्रकाश का प्राथमिक स्रोत सामान्यतः अलमारियों पर लगे बल्ब होते हैं। ऊपर से आने वाले बल्बों की संख्या कम से कम रखी जा सकती है, क्योंकि इनका उपयोग केवल अंधेरे चक्र के दौरान ही किया जाएगा। पारंपरिक नीचे की ओर से आने वाली रोशनी से पौधों को एकसमान प्रकाश नहीं मिल पाता है। रैक पर सीधे लगे बल्बों से ऊष्मा का वितरण असमान होता है। पार्श्व रोशनी एक वैकल्पिक व्यवस्था है, जिसमें कम बल्बों की आवश्यकता होती है और अधिक एकसमान प्रकाश मिलता है। लेकिन पौधों को अलमारियों पर इधर-उधर ले जाते समय बल्बों को टूटने से बचाना आवश्यक है। वृद्धि कक्ष के लिए 1,00,000 की रोगाणुहीनता श्रेणी वांछनीय है।

सूक्ष्म प्रसार के लाभ:-  सूक्ष्म प्रसार के पारंपरिक प्रसार विधियों की तुलना में कई लाभ हैं, जैसे:

1. तीव्र गुणन:-  सूक्ष्म प्रसार वांछित पादप प्रजातियों का तीव्र गुणन प्रदान करता है।

2. केवल सीमित संख्या में प्रत्यारोपण की आवश्यकता:-   पौधे के छोटे टुकड़ों (प्रत्यारोपण)/ऊतक का उपयोग अपेक्षाकृत कम जगह में बड़ी संख्या में पौधे पैदा करने के लिए किया जा सकता है।

3. एकसमान या मूल प्रजाति के पौधे:- सूक्ष्म प्रसार से पौधों में शारीरिक/रूपरूपिक एकरूपता का उच्च स्तर प्राप्त होता है। उत्पादन चक्र नियंत्रित परिस्थितियों में होता है, इसलिए बाजार की मांग के आधार पर उचित योजना और समय-निर्धारण संभव है। पारंपरिक रूप से उगाए गए पौधों की तुलना में इस प्रकार प्राप्त उत्पाद में एकरूपता का स्तर बहुत अधिक होता है।

4. जर्मप्लाज्म भंडारण:- पौधों को कम जगह में इन विट्रो में संग्रहित किया जा सकता है और स्टॉक पौधों के रखरखाव के लिए कम श्रम की आवश्यकता होती है।

5. रोगमुक्त रोपण सामग्री:-  ऊतक संवर्धन द्वारा उत्पादित पौधे आमतौर पर रोगमुक्त होते हैं। उचित निदान और उपचार से बड़े पैमाने पर प्रसार से पहले कवक, जीवाणु और विषाणुओं का उन्मूलन संभव है। सीरोलॉजिकल और आणविक तकनीक की सहायता से, बड़े पैमाने पर गुणन के लिए उपयोग किए जाने वाले मातृ पौधे/अंकुर में मौजूद विषाणुओं का सूचकांक निर्धारित करना संभव है। 

6. वृद्धि में हेरफेर:- पोषक तत्वों के स्तर, प्रकाश, तापमान और अन्य कारकों को वृद्धि, गुणन और पुनर्जनन में हेरफेर करने के लिए अधिक प्रभावी ढंग से नियंत्रित किया जा सकता है।

7. साल भर उत्पादन:-  सूक्ष्म प्रसार ऋतु से स्वतंत्र है। चूंकि सूक्ष्म प्रसार पूरे वर्ष किया जा सकता है, इसलिए उत्पादन चक्र को चरम मांग को पूरा करने के लिए निर्धारित किया जा सकता है।

8. तीव्र प्रसार संभव है:- जिन प्रजातियों का पीढ़ी समय लंबा होता है, बीज उत्पादन का स्तर कम होता है, या जिनके बीज आसानी से अंकुरित नहीं होते हैं, उनके लिए ऊतक संवर्धन के माध्यम से तीव्र प्रसार संभव है।

9. प्रतीक्षा करने की आवश्यकता नहीं:- आवश्यक समय बहुत कम हो गया है, बीज के विकास के पूरे जीवन चक्र के लिए प्रतीक्षा करने की आवश्यकता नहीं है।

परागकण संवर्धन (Pollen Culture):-

1. परिचय (Introduction):-

·         परिभाषा (Definition):- 

परागकण या लघुबीजाणु संवर्धन एक कृत्रिम प्रक्रिया है जिसमें निर्जमित परिस्थितियों में परागकण या लघुबीजाणु को इसकी एककेन्द्रकी अवस्था पर साबुत परागकोष से निकाला जाता है और पोषक माध्यम पर संवर्धित किया जाता है।

(Pollen grain or microspore culture is an artificial process in which pollens or microspores are extracted from the intact anther at its uni-nucleated state and cultured on the nutrient medium under sterilized conditions.)

·         एंड्रोजेनेसिस (Androgenesis):- पूर्णशक्त परागकण से कोशिका विभाजन व विभेदन की श्रंखला द्वारा अगुणित पौधों के कृत्रिम रूप से विकसित होने की प्रक्रिया को एंड्रोजेनेसिस कहते हैं। यह 2 प्रकार का होता है –

(The process of artificial development of haploid plants by a series of cell division and differentiation from a totipotent pollen is called androgenesis. It is of two types -)

i. प्रत्यक्ष एंड्रोजेनेसिस (Direct Androgenesis):- 

लघुबीजाणु जाइगोट के समान व्यवहार करता है तथा कुछ परिवर्तनों द्वारा भ्रूण समान संरचना का निर्माण करता है जो आगे अगुणित पौधे में विकसित हो जाता है। इसे भ्रूणजनन कहते हैं।

(The microspore behaves like a zygote and by some changes the it forms a embryo like structure which further develops into haploid plants. This is called embryogenesis.)

ii. अप्रत्यक्ष एंड्रोजेनेसिस (Indirect Androgenesis):- 

लघुबीजाणु बार बार विभाजित होकर कैलस ऊतक का निर्माण करता है। इसमें विभेदन होने से अगुणित पौधा बन जाता है। इसे अंगजनन कहते हैं।

(The microspore divides repeatedly to form the callus tissue. Differentiation leads to development of haploid plant. This is called organogenesis.)

2. सिद्धान्त (Principle):-

·         लघुबीजाणु की पूर्णशक्तता के उपयोग से अगुणित पौधे का निर्माण किया जाता है।

(The haploid plant is developed using the totipotency of the microspore.)

·         लघुबीजाणु में गुणसूत्रों का केवल एक समुचय उपस्थित होता है।

(Only one set of chromosomes is present in the microspore.)

·         अगुणित पादप निर्माण की प्रक्रिया में लघुबीजाणु का नर युग्मक निर्माण का सामान्य विकास व कार्य रुक जाता है। कायिक कोशिका विभाजन के लिए इसे बलपूर्वक नए उपापचय पथ की ओर मोड़ दिया जाता है।

(In the process of haploid plant development, the normal development and function of the microspore of the male gametes formation stops. It is forced into a new metabolic pathway for somatic cell division.)

·          परागकोष संवर्धन में परागकोष की द्विगुणित कायिक कोशिकाएं भी कभी कभी संवर्धन परिस्थितियों में सक्रिय हो जाती हैं और संवर्धित होकर अनचाहे द्विगुणित कैलस या प्लांटलेट्स का निर्माण करती हैं। कभी कभी काइमेरा बन जाता है। ऐसा कैलस या प्लांटलेट जिसकी कुछ कोशिकाएं अगुणित व कुछ कोशिकाएं द्विगुणित होती हैं, काइमेरा कहलाता है। इस समस्या से बचने परागकोषों से निकाले गए स्वतंत्र परागकणों को पोषक माध्यम पर संवर्धित किया जाता है।

(In pollen culture, diploid somatic cells of the anther also sometimes become active under culturing conditions and grow to form unwanted diploid callus or plantlets. Sometimes the chimera is formed. A callus or plantlet whose some cells are haploid and some cells are diploid, is called chimera. To avoid this problem, free pollens extracted from the anthers are cultured on the nutrient medium.)

3. विधि (Procedure):-

·         पुष्पन पर तंबाकू की बन्द पुष्पीय कलिकाओं को एकत्रित करते हैं। 17 – 22 mm लंबाई की पुष्पीय कालिका का चयन करते हैं जब बाह्यदलों की लंबाई दलों की लंबाई के बराबर होती है। खुल रही सभी पुष्पीय कलिकाओं को त्याग देते हैं।

(Collect the closed floral buds of the tobacco upon flowering. A floral bud of length 17 - 22 mm is selected when the length of the sepals is equal to the length of the petals. Discards all opening floral buds.)

·         चयनित पुष्पीय कलिकाओं को LAF कैबिनेट के अन्दर ले जाते हैं। प्रत्येक पुष्पीय कालिका में 5 परागकोष होते हैं और बन्द कलिकाओं के अन्दर इनकी सतह स्वत: निर्जमित होती है। पुष्पीय कलिकाओं के सतही निर्जमीकरण के लिए इन्हें पहले 10 सेकंड के लिए 70% ऐथेनोल में डुबोकर रखते हैं और फिर 10 मिनट के लिए 20% सोडियम हाइपोक्लोराइट विलयन में डुबोकर रखते हैं। अतिरिक्त रसायन को सतह से हटाने के लिए पुष्पीय कलिकाओं को निर्जमित आसुत जल से 3 बार धोते हैं। अंत में इन पुष्प कलिकाओं को निर्जमित पेट्रीडिश में स्थानांतरित कर देते हैं।

(Selected floral buds are carried inside the LAF cabinet. Each floral bud contain 5 anther and its surface is self sterilized within the closed buds. For surface sterilization of the floral buds, first dip them in 70% ethanol for 10 seconds and then in 20% sodium hypochlorite solution for 10 minutes. To remove excess chemicals from the surface, the floral buds are washed 3 times with sterilized distilled water. Finally these floral buds are transferred to the sterilized patridish.)

·          अब एक तीखे चाकू के द्वारा कालिका के एक तरफ कट लगाते हैं और चिमटी की सहायता से दलों व बाह्यदलों को हटा देते हैं। अब एक अन्य चिमटी की सहायता से 5 पुंकेसरों को पुतन्तु सहित उखाड़कर एक अन्य निर्जमित पेट्रीडिश में स्थानांतरित करते हैं। अब 5 पुंकेसरों के पुतन्तुओं को चाकू या ब्लेड से काटकर अलग कर देते हैं जिससे केवल परागकोष रह जाते हैं। क्षतिग्रस्त परागकोषों को भी त्याग देते हैं।

(Now with a sharp knife, cut one side of the bud and remove the sepals and petals with the help of forceps. Now uproot 5 stamens along with filaments with the help of another forceps and transfer them to another sterilized patridish. Now cut the filaments of 5 stamens with a knife or blade, leaving only the anthers. Discard damaged anthers.)

·         लगभग 50 परागकोषों को 20ml द्रव माध्यम युक्त एक छोटे निर्जमित बीकर में डालते हैं। द्रव माध्यम के रूप में MS या White या Nitsch का माध्यम ले सकते हैं।

(Almost 50 anthers are placed in a small sterilized beaker containing 20ml of liquid medium. MS or White or Nitsch medium can be used as the liquid medium.)

·         अब एक निर्जमित ग्लास रोड की सहायता से परागकोषों को बीकर की आंतरिक दीवार के साथ दबाते हैं जिससे परागकण बाहर द्रव माध्यम में आ जाते हैं।

(Now the anthers are pressed along the inner wall of the beaker with the help of a sterilized glass road, bringing the pollen out into the liquid medium.)

·         अब इन एकरूप परागकोषों को नायलोन की छलनी से छानते हैं जिससे परागकोष ऊतक के टुकड़े पृथक हो जाते हैं। शेष बचे छनित को अब परागकण निलंबन कहते हैं।

(Now these squeezed anthers are filtered with a nylon sieve, which separates the pieces of anthers. The remaining filtrate is now called pollen suspension.)

·         अब इस परागकण निलंबन को 5 मिनट के लिए कम स्पीड (500 – 800 RPM) पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। अधिप्लवी में परागकोषों  छोटे टुकड़े उपस्थित होते हैं इसलिए इसे त्याग देते हैं। परागकणों की पैलेट को ताजा द्रव माध्यम में निलंबित करते हैं। 

(Now this pollen suspension is centrifuged at low speed (500 - 800 RPM) for 5 minutes. Small pieces of anthers are present in the supernatant, so discard it. The palette of pollens is suspended in fresh liquid medium.)

·     सेंट्रीफ्यूगेशन व ताजा द्रव माध्यम में पुन: निलम्बन को दोहराकर 2 बार परागकणों को धो लेते हैं।

(After repeated centrifugation and suspended fresh liquid medium, pollens are washed twice.)

·     अब एक 5cm पेट्रीडिश में द्रव माध्यम लेते हैं। पिपेट के उपयोग से 2.5ml परागकण निलम्बन लेकर ठोस द्रव माध्यम पर 5cm पेट्रीडिश में फैला देते हैं। परागकण द्रव माध्यम में बहुत अच्छी वृद्धि करते हैं, परन्तु यदि आवश्यक हो तो इन्हें प्लेटिंग के द्वारा बहुत कोमल अगार युक्त माध्यम पर भी उगाया जा सकता है। 1 ml परागकण निलम्बन में 10³ से 10⁴ तक परागकण होते हैं।

(Now take liquid medium in a 5cm patridish. Using a pipette, take 2.5ml pollen suspension and spread it on 5cm patridish on liquid medium. Pollens grow very well in the liquid medium, but they can also be grown on a very soft agar medium by plating, if necessary. 1 ml pollen suspension contain 10³ to 10⁴ pollens.)

·         अब इन पेट्रीडिशों को इंक्यूबेटर में रखकर 27 – 30°C ताप पर ऊष्मायन किया जाता है। 16 घण्टे का प्रकाश व 8 घण्टे का अंधेरा दिया जाता है। प्रकाश की तीव्रता कम (500 लक्स) रखी जाती है।

[Now these petridishes are kept in incubator and incubate at 27 - 30 ° C temperature. 16 hours of light and 8 hours of darkness is given. Light intensity is kept low (500 lux).]

·         30 दिन के पश्चात तरुण भ्रूण समान संरचनाएं देखी जा सकती हैं।

(After 30 days young embryo like structures can be seen.)

·     अब इन अगुणित भ्रूणो को नये ताजा अगार माध्यम पर संवर्धन ट्यूब में स्थापित करते हैं।  इस अवस्था पर संवर्धनों का 24 – 28°C ताप पर ऊष्मायन किया जाता है। 14 घंटे का प्रकाश व 10 घंटे का अंधकार दिया जाता है। प्रकाश की तीव्रता 2000 लक्स रखी जाती है।

(Now these haploid embryos are placed in a culture tube on new fresh agar medium. At this stage the cultures are incubated at 24 - 28 ° C temperature. 14 hours of light and 10 hours of darkness are given. Light intensity is maintained at 2000 lux.)

·         जब अगुणित प्लांटलेट्स की लंबाई 50 mm हो जाती है तो अगार माध्यम से स्वतंत्र करने के लिए नल के बहते हुए पानी में धोया जाता है। अब तुरन्त इन्हें औटोक्लेवित कम्पोस्ट युक्त छोटे गमलों में रोपित कर दिया जाता है। शुष्कन को रोकने के लिए प्रत्येक पौधे को काँच के बीकर से ढक देते हैं और आगे के परिवर्धन के लिए नम ग्रीन हाउस में रख देते हैं। कुछ सप्ताहों पश्चात काँच के बीकरों को हटा देते हैं और पौधों को मृदा युक्त बड़े गमलों में रोपित कर देते हैं जहाँ ये पौधे परिपक्व होकर अंत में पुष्पन करते हैं।

(When the length of haploid plantlets is 50 mm, they are washed in running water to free it from the agar medium. Now they are immediately planted in small pots with autoclaved compost. To prevent drying, cover each plant with a glass beaker and place it in a moist greenhouse for further growth. After a few weeks, the glass beakers are removed and the plants are planted in large pots containing soil where these plants mature and eventually flowering.)

4. लाभ (Advantages):-  

·         आधारभूत अनुसंधान के लिए परागकण संवर्धन की उपयोगिता (Utility of Pollen Culture for Basic Research)

·          सरल (Simple)

·          कम समय लेता है (Less Time Consuming)

·          उत्तरदायी (Responsive)

·         उत्परिवर्तन का अध्ययन (Mutation Study):-

Ø  अगुणित पौधों में प्रत्येक जीन का केवल एक ही युग्मविकल्पी पाया जाता है। इसलिए कोई भी अप्रभावी उत्परिवर्तन या लक्षण स्पष्ट रूप से दिखाई देता हैं।

(In haploid plants, only one allele of each gene is found. Therefore any recessive mutation or trait are clearly visible.)

Ø   घातक जीनों युक्त पौधे जीन पूल से निष्कासित हो जाते हैं।

(Plants containing lethal genes are expelled from the gene pool.)

Ø   इस प्रकार उत्परिवर्तन का अध्ययन आसानी से किया जा सकता है।

(Thus mutation can be studied easily.)

·          क्रायोजेनिक अध्ययन के लिए अगुणितों का उपयोग (Use of Haploids for Cryogenic Study)

·          पादप प्रजनन व फसल सुधार के लिए उपयोग (For Plant Breeding and Crop Improvement):- 

Ø  समयुग्मजी वंशक्रमों को उत्पन्न किया जा सकता है। इसके लिए अगुणित पौधों को कोल्चिसीन रसायन से उपचारित किया जाता है।

(Homozygous lines can be produced. For this, haploid plants are treated with colchicine chemical.)

Ø   उत्परिवर्तन प्रजनन विधि का उपयोग फसल सुधार में किया जाता है।

(Mutation breeding method is used in crop improvement.)

·         बागवानी पौधों के लिए अगुणित संवर्धन का अनुप्रयोग (Application of Haploid Culture for Horticultural Plants)

·          द्वितीयक मेटाबोलाइट्स के अध्ययन के लिए (For Study of Secondary Metabolites Content)

5. हानियाँ (Disadvantages):-

·         बिना क्षति पहुंचाए परागकोषों व परागकणों को निकालने के लिए कौशल की आवश्यकता होती है।

(Skill is required to remove anthers and pollens without damaging them.)

·          धान्य फसलों में यह बहुत अधिक सफल विधि नहीं है।

(This is not a very successful method in cereal crops.)

विभज्योतक संवर्धन (Meristem Culture):-

·         परिभाषा (Definition):- 

जब निर्जमित दशाओं में प्ररोह के 0.1 से 1 mm शीर्ष भाग को पृथक करके कर्तोतक के रूप में उपयोग करते हुए संवर्धित किया जाता है तो इसे प्ररोह शिखाग्र संवर्धन कहते हैं। शीर्ष भाग में 0.05 से 0.1 mm विभज्योतक पाया जाता है, इसलिए इसे विभज्योतक संवर्धन भी कहते हैं।

(When in sterilized conditions 0.1 to 1 mm tip of the shoot is removed and cultured using it as an explant, it is called shoot tip culture. The 0.05 to 0.1 mm meristem is found in the apex, so it is also called meristem culture.)

·         विभज्योतक संवर्धन वायरस मुक्त पौधे प्राप्त करने के लिए किया किया जाता है। विभज्योतक में कोशिकाओं का विभेदन नहीं होता है। संवहन ऊतक अनुपस्थित होता है। विभज्योतक कोशिकाओं में तीव्र उपापचय क्रिया होती है। वायरस एक कोशिका से दूसरी कोशिका में गति नहीं कर सकता।

(The meristem culture is performed to obtain virus-free plants. Differentiation of cells does not occur in the meristem. Vascular tissue is absent. Meristem cells have a rapid metabolic activity. The virus cannot move from one cell to another.)

·         विधि (Procedure):-

Ø  एक स्वस्थ पौधे से तरुण टहनियों को काटते हैं। तरुण टहनी के 1cm शीर्ष भाग को काटकर अलग कर लेते हैं।

(Cut young twigs from a healthy plant. Now cut 1cm top part of the young twig.)

Ø  1-1cm लम्बे शीर्ष भागों के सतही निर्जमीकरण के लिए 1℅ सोडियम हाइपोक्लोराइट के विलयन में 10 मिनट   तक ऊष्मायन करते हैं। अब इन शीर्ष भागों को 4 बार निर्जमित आसुत जल से धो लेते हैं ताकि सतह पर   उपस्थित अतिरिक्त रसायन हट जाये।

(For surface sterilization we incubate 1–1cm long top parts in a solution of 1℅ sodium hypochlorite for 10 minutes . Now wash these top parts with sterilized distilled water 4 times so that the excess chemical present on the surface is removed.)

Ø  अब प्रत्येक शीर्ष भाग को निर्जमित पेट्रीडिश में डालते हैं।

(Now put each top part in a sterilized patridish.)

Ø  अब प्रत्येक शीर्ष भाग से बाहरी पत्तियों को हटा देते हैं जिससे प्ररोह शिखाग्र दिखाई देने लगता है।

(Now remove the outer leaves from each apex so that shoot tips make visible.)

Ø  अब ब्लेड या चाकू की सहायता से 1mm लम्बे प्ररोह शिखाग्र को काट लेते हैं तथा इसे अगार माध्यम की सतह पर स्थानान्तरित कर देते हैं।

(Now 1 mm long shoot tips are cut with the help of a blade or knife, and transfer on to the surface of the agar medium.)

Ø  अब इस संवर्धन का 25°C ताप व 16 घंटे प्रकाश काल पर ऊष्मायन करते हैं। जिससे कुछ दिनों में पहले प्ररोह तंत्र व बाद में मूल तंत्र विकसित हो जाता है। अब इन पौधों को गमलों में प्रतिस्थापित कर देते हैं।

(Now incubate this culture at 25 ° C temperature and 16 hours light period. As a result the shoot system is developed first and then the root system develops in a few days. Now establish these plants in pots.)

·         Stages (अवस्थाएँ):- मुराशिग ने विभज्योतक संवर्धन में 3 अवस्थाओं के बारे में बताया है-

(Murashig has described 3 stages in the meristem culture-)

1. Stage – I:- इस अवस्था में संवर्धन स्थापित होता है जिसमें कर्तोतक से एकल या बहु प्ररोह विकसित होते हैं। इस अवस्था पर माध्यम में बाहर से साइटोकायनिन जैसे – BA, Kinetin व 2-iP की सप्लाई दी जाती है।

(Culture is established in this stage in which single or multiple shoots are developed from the explant. At this stage, the medium is supplemented with cytokine such as BA, Kinetin and 2-iP.)

2. Stage – II:- इस अवस्था का उद्देश्य प्रवर्धों का बहुगुणन होता है जिसके लिए कक्षस्थ प्ररोह प्रवर्धन होता है। यह उच्च आनुवंशिक स्थायित्व को बनाए रखता है।

(The purpose of this stage is multiplication of propagules for which the axillary shoot propagation occurs. It maintains high genetic stability.)

3. Stage – III:- इस अवस्था का उद्देश्य Stage – II में प्राप्त प्ररोह से अपस्थानिक जड़ों का निर्माण करना होता है। अपस्थानिक मूल निर्माण को प्रेरित करने के लिए माध्यम में बाहर से क्रमश: NAA, IBA, IAA, 2,4-D व अन्य ऑक्सिन हार्मोन्स की सप्लाई दी जाती है।

(The purpose of this stage is to develop the adventitious roots from the shoots obtained in Stage - II. The medium is supplemented externally with NAA, IBA, IAA, 2,4-D and other auxin hormones to induce adventitious root formation.)

·         अनुप्रयोग (Applications):-

1. वायरस से मुक्ति (Virus Elimination):-

Ø  पौधे सामान्यतया एक से अधिक प्रकार के वायरसों से संक्रमित होते हैं। जिनमें से कुछ अज्ञात होते हैं।

(Plants are usually infected with more than one type of viruses. Some of which are unknown.)

Ø  विभज्योतक संवर्धन के द्वारा हम वायरस से संक्रमित पौधे से स्वस्थ वायरस मुक्त पौधों को विकसित कर सकते हैं। जैसे – आलू ।

(We can grow healthy and virus free plants from virus-infected plants through meristem culture. Like - Potatoes.)

2. सूक्ष्म प्रवर्धन (Micro propagation):-

Ø  पौधे के किसी सूक्ष्म कायिक भाग से ऊतक संवर्धन तकनीक द्वारा सम्पूर्ण पौधे के निर्माण की प्रक्रिया को सूक्ष्म प्रवर्धन कहते हैं।

(The process of regeneration of the entire plant by tissue culture technique from any vegetative part of the plant is called micro propagation.)

Ø  विभज्योतक संवर्धन एक प्रकार का सूक्ष्म प्रवर्धन ही है।

(Meristem culture is a kind of micro propagation.)

3. आनुवंशिक संसाधनों का भंडारण (Storage of Genetic Resources):-

Ø  अनेक पौधे ऐसे बीज उत्पन्न करते हैं जो प्रकृति में उच्च विषमयुग्मनज होते हैं या दुर्दम्य (recalcitrant) होते हैं। इस प्रकार के बीजों को आनुवंशिक संसाधनों के भंडारण के लिए स्वीकृत नहीं किया जाता है।

(Many plants produce seeds that are highly heterozygous in nature or recalcitrant. These types of seeds are not approved for storage of genetic resources.)

Ø  अत: इन पौधों से विभज्योतक को लेकर कृत्रिम रूप से संग्रहित किया जा सकता है।

(Hence, meristem taken from these plants can be stored artificially.)

4. संगरोध (Quarantine):-

Ø  प्ररोह शिखाग्र संवर्धन या विभज्योतक संवर्धन से विकसित पौधे बिना जांच के अंतर्राष्ट्रीय विनिमय के लिए संगरोध प्राधिकरण के द्वारा आसानी से स्वीकृत कर लिया जाता है।

(Plants grown from shoot tip culture or meristem culture are easily approved by the quarantine authority for international exchange without testing.)

Ø  इसलिए इस तकनीक के उपयोग से फसल सुधार प्रोग्राम में विश्व के किसी भी भाग से फसली पौधों को आसानी से आयात किया जा सकता है।

(Therefore, crop plants can be easily imported from any part of the world using this technique for crop improvement program.)

Role of plant biotechnology in crop improvement, horticulture, forestry and conservation of biodiversity:-

Role of plant biotechnology in crop improvement, horticulture, forestry:- The role of biotechnology in agriculture is multifaceted. Some of the most prevalent benefits of biotechnology in agriculture include –

1. Increase in Crop Production:- With better disease control and increased tolerance to drought and flooding, biotechnology leads to a significant increase in crop production. This does not just match the ever-growing demand for food but also helps farmers to lower losses. 

2. Better Crop Protection:- The techniques of biotechnology serve as cost-effective solutions to problems about pests. Farmers have been able to transform crops like cotton, corn, and potato to synthesize a protein that tackles issues of pests effectively. 

3. Increase in Nutrition Value:- It has also enabled farmers to produce crops with a higher nutritional value and enhanced flavour and texture. For instance, the technology has made it possible to cultivate soybeans with high protein content, beans with more amino acids, and potatoes with starch. 

4. Fresher Produce and Better Taste:- It further helps to improve the taste and flavor of crops by enhancing the activity of enzymes present in plants. Also, it helps in keeping the yield fresh for longer. 

5. Chemical Tolerance:- Most farmers rely on herbicides to control the growth of weeds which often leads to soil erosion. However, genetically engineered food is resistant to a variety of chemicals, including herbicides; as a result, the scale of soil erosion is significantly low.

6. Disease Resistance:- Viral infections spread by insects are often difficult to contain, and also the use of insecticides tends to pose a threat to both soil and the quality of produce. Nonetheless, genetically modified plants are less susceptible to viral infection and make it easier for farmers to contain crop damage. 

Biotech for Conservation:- At present, loss of specific species, groups of species (extinction) or decrease in number of particular organisms (endangerment) are taking place in different parts of the world at a rapid pace. These losses are often manifestations of degradation or destruction in the ecosystem or habitat.4 According to the Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO), it is estimated that about three-quarter of the genetic diversity in agricultural crops have been lost over the last century due to various reasons such as combination of different agricultural production systems and globalization.

DNA Banks:-

> More plant conservationists are turning to DNA technologies to have effective conservation strategies. The DNA bank is an efficient, simple and long-term method used in conserving genetic resource for biodiversity. Compared to traditional seed or field gene banks, DNA banks lessen the risk of exposing genetic information in natural surroundings. It only requires small sample size for storage and keeps the stable nature of DNA in cold storage. Since whole plants cannot be obtained from DNA, the stored genetic material must be introduced through genetic techniques.

> A number of DNA banks are present worldwide which include those managed by the International Rice Research Institute, South African National Biodiversity Institute, and National Institute of Agrobiological Sciences in Japan. 

> Gene bank documentation has been enhanced with the advances in information technology, geographical information systems (GIS), and DNA marker technology. Information on DNA assessment of variation derived through these technologies help search for important genes. Information from DNA collections are available online through biodiversity initiatives such as Global Biodiversity Information (www.gbif.net), Species 2000 (www.species2000.org), and Inter-American Biodiversity Network (www.ukbiodiversity.net).

> In vitro techniques are also valuable for conserving plant biodiversity. Such techniques involve three basic steps: culture initiation, culture maintenance and multiplication, and storage. For medium-term storage (few months to few years), slow growth strategies are applied. 

> For undefined time of storage, cryopreservation is applied. In cryopreservation, plant tissues are processed to become artificial seeds and stored at very low temperatures to impede growth. Cryopreservation allows 20 percent increase in regeneration process compared to other conservation methods. 

फसल सुधार, बागवानी, वानिकी और जैव विविधता संरक्षण में पादप जैव प्रौद्योगिकी की भूमिका:-

फसल सुधार, बागवानी और वानिकी में पादप जैव प्रौद्योगिकी की भूमिका:-  कृषि में जैव प्रौद्योगिकी की भूमिका बहुआयामी है। कृषि में जैव प्रौद्योगिकी के कुछ सबसे प्रचलित लाभों में शामिल हैं –

1. फसल उत्पादन में वृद्धि:- बेहतर रोग नियंत्रण और सूखे व बाढ़ के प्रति बढ़ी सहनशीलता के कारण जैव प्रौद्योगिकी से फसल उत्पादन में उल्लेखनीय वृद्धि होती है। इससे न केवल भोजन की लगातार बढ़ती मांग पूरी होती है, बल्कि किसानों को नुकसान कम करने में भी मदद मिलती है। 

2. बेहतर फसल संरक्षण:- जैव प्रौद्योगिकी की तकनीकें कीटों से संबंधित समस्याओं के किफायती समाधान प्रदान करती हैं। किसानों ने कपास, मक्का और आलू जैसी फसलों को रूपांतरित करके एक ऐसा प्रोटीन संश्लेषित करने में सफलता प्राप्त की है जो कीटों की समस्याओं से प्रभावी ढंग से निपटता है। 

3. पोषण मूल्य में वृद्धि:- इसने किसानों को उच्च पोषण मूल्य और बेहतर स्वाद एवं बनावट वाली फसलें उगाने में भी सक्षम बनाया है। उदाहरण के लिए, इस तकनीक ने उच्च प्रोटीन सामग्री वाली सोयाबीन, अधिक अमीनो एसिड वाली फलियाँ और स्टार्च युक्त आलू की खेती को संभव बनाया है। 

4. ताज़ी उपज और बेहतर स्वाद:- यह पौधों में मौजूद एंजाइमों की सक्रियता बढ़ाकर फसलों के स्वाद और सुगंध को बेहतर बनाने में मदद करता है। साथ ही, यह उपज को लंबे समय तक ताज़ा रखने में भी सहायक होता है। 

5. रासायनिक सहनशीलता:- अधिकांश किसान खरपतवारों की वृद्धि को नियंत्रित करने के लिए खरपतवारनाशकों पर निर्भर रहते हैं, जिससे अक्सर मिट्टी का कटाव होता है। हालांकि, आनुवंशिक रूप से संशोधित खाद्य पदार्थ खरपतवारनाशकों सहित कई रसायनों के प्रति प्रतिरोधी होते हैं; परिणामस्वरूप, मिट्टी का कटाव काफी कम होता है।

6. रोग प्रतिरोधक क्षमता:- कीटों द्वारा फैलने वाले वायरल संक्रमणों को नियंत्रित करना अक्सर कठिन होता है, और कीटनाशकों का उपयोग मिट्टी और फसल की गुणवत्ता दोनों के लिए खतरा पैदा करता है। हालांकि, आनुवंशिक रूप से संशोधित पौधे वायरल संक्रमण के प्रति कम संवेदनशील होते हैं और किसानों के लिए फसल को होने वाले नुकसान को नियंत्रित करना आसान बनाते हैं। 

संरक्षण के लिए जैव प्रौद्योगिकी:-  वर्तमान में, विश्व के विभिन्न भागों में विशिष्ट प्रजातियों, प्रजातियों के समूहों का विलुप्त होना या विशिष्ट जीवों की संख्या में कमी आना (संकटग्रस्त होना) तीव्र गति से हो रहा है। ये हानियाँ अक्सर पारिस्थितिकी तंत्र या पर्यावास में गिरावट या विनाश के परिणाम स्वरूप होती हैं।4 संयुक्त राष्ट्र के खाद्य और कृषि संगठन (एफएओ) के अनुसार, यह अनुमान लगाया गया है कि विभिन्न कृषि उत्पादन प्रणालियों के संयोजन और वैश्वीकरण जैसे विभिन्न कारणों से पिछली शताब्दी में कृषि फसलों में लगभग तीन-चौथाई आनुवंशिक विविधता का नुकसान हुआ है।

डीएनए बैंक:-

अधिकाधिक पौध संरक्षणवादी प्रभावी संरक्षण रणनीतियों के लिए डीएनए प्रौद्योगिकियों की ओर रुख कर रहे हैं। डीएनए बैंक जैव विविधता के लिए आनुवंशिक संसाधनों के संरक्षण में प्रयुक्त एक कुशल, सरल और दीर्घकालिक विधि है। पारंपरिक बीज या क्षेत्र जीन बैंकों की तुलना में, डीएनए बैंक प्राकृतिक वातावरण में आनुवंशिक जानकारी के उजागर होने के जोखिम को कम करते हैं। इसमें भंडारण के लिए केवल छोटे नमूने की आवश्यकता होती है और ठंडे भंडारण में डीएनए की स्थिर प्रकृति बनी रहती है। चूंकि डीएनए से संपूर्ण पौधे प्राप्त नहीं किए जा सकते, इसलिए संग्रहित आनुवंशिक सामग्री को आनुवंशिक तकनीकों के माध्यम से ही प्राप्त किया जाना चाहिए।

विश्व भर में कई डीएनए बैंक मौजूद हैं, जिनमें अंतर्राष्ट्रीय चावल अनुसंधान संस्थान, दक्षिण अफ्रीकी राष्ट्रीय जैव विविधता संस्थान और जापान में राष्ट्रीय कृषि जैविक विज्ञान संस्थान द्वारा प्रबंधित संस्थान शामिल हैं। 

सूचना प्रौद्योगिकी, भौगोलिक सूचना प्रणाली (जीआईएस) और डीएनए मार्कर प्रौद्योगिकी में हुई प्रगति के कारण जीन बैंक प्रलेखन में सुधार हुआ है। इन प्रौद्योगिकियों के माध्यम से प्राप्त डीएनए भिन्नता मूल्यांकन संबंधी जानकारी महत्वपूर्ण जीनों की खोज में सहायक होती है। डीएनए संग्रहों से प्राप्त जानकारी ग्लोबल बायोडायवर्सिटी इंफॉर्मेशन (www.gbif.net), स्पीशीज 2000 (www.species2000.org) और इंटर-अमेरिकन बायोडायवर्सिटी नेटवर्क (www.ukbiodiversity.net) जैसी जैव विविधता पहलों के माध्यम से ऑनलाइन उपलब्ध है।

पौधों की जैव विविधता के संरक्षण के लिए इन विट्रो तकनीकें भी महत्वपूर्ण हैं। इन तकनीकों में तीन बुनियादी चरण शामिल हैं: संवर्धन की शुरुआत, संवर्धन का रखरखाव और गुणन, और भंडारण। मध्यम अवधि के भंडारण (कुछ महीनों से लेकर कुछ वर्षों तक) के लिए, धीमी वृद्धि रणनीतियों का उपयोग किया जाता है। 

अनिश्चित समय तक भंडारण के लिए क्रायोप्रिजर्वेशन विधि का प्रयोग किया जाता है। क्रायोप्रिजर्वेशन में, पौधों के ऊतकों को कृत्रिम बीजों में परिवर्तित किया जाता है और वृद्धि को बाधित करने के लिए उन्हें बहुत कम तापमान पर संग्रहित किया जाता है। क्रायोप्रिजर्वेशन अन्य संरक्षण विधियों की तुलना में पुनर्जनन प्रक्रिया में 20 प्रतिशत की वृद्धि की अनुमति देता है।