Gene transfer in plants, agro bacterium mediated gene transfer. Crown gall disease, the tumour inducing principle and Ti plasmid, incorporation of T- DNA into plant cells

Indirect Gene Transfer:- When stable transformation is achieved by incorporating genes into the genome of plant cells with the help of a biological factor, it is called indirect gene transfer. Agrobacterium bacterium is used in this.

Agrobacterium mediated Gene Transfer:-

•  Agrobacterium is a gram -ve bacterium found in soil around plant roots.

•  Two species of Agrobacterium bacteria cause diseases in dicot plants:-

i. Agrobacterium tumefaciens

ii. Agrobacterium rhizogenes

i. Agrobacterium tumefaciens:- It causes Crown gall disease in angiosperm plants. Ti-plasmid is found in it.

ii. Agrobacterium rhizogenes:- It cause hairy root disease in angiosperm plants. Ri - plasmid is found in it.

•  Recombinant DNA is made by incorporating the desired gene into the T - DNA portion of the Ti plasmid. Which are transferred to Agrobacterium cell.

•  Now cut round pieces of sterilized leaf.

•  Now incubate these pieces with Agrobacterium overnight.

•  Now kept these pieces in Shooting medium for 2 days.

•  Now add Kanamycin and Carbenicillin in this shooting medium and cultured for 3-4 weeks.

•  Now transfer this to the rooting medium, add Kanamycin and Carbenicilin, culture it for 3-4 weeks.

•  Now establish this plant in a pot in green house.

•  After a few days, establish the plant in the soil of the field.

Mechanism of Gene Transfer:-

•  The T - DNA portion of the Ti - plasmid has the property that it can integrate into the plant's genome.

•  Leaf pieces release the Aceto - Syringine chemical that activates the Vir - Operon of T - DNA.

•  Once activated, the T-DNA portion separates from the plasmid and enters into many plant cells.

•  Now this T-DNA integrates into the genome by going into the nucleus.

•  This results in stable transformation of the plant.

पौधों में जीन स्थानांतरण, कृषि जीवाणु द्वारा जीन स्थानांतरण। क्राउन गॉल रोग, ट्यूमर उत्पन्न करने वाला सिद्धांत और टीआई प्लास्मिड, पादप कोशिकाओं में टी-डीएनए का समावेश।

अप्रत्यक्ष  जीन  स्थानांतरण :-  जब किसी जैविक कारक की सहायता से पादप कोशिकाओं के जीनोम में जीन को शामिल करके स्थायी रूपांतरण प्राप्त किया जाता है, तो इसे अप्रत्यक्ष जीन स्थानांतरण कहते हैं। इसमें एग्रोबैक्टीरियम बैक्टीरिया का उपयोग किया जाता है।

एग्रोबैक्टीरियम द्वारा मध्यस्थता से जीन स्थानांतरण:-

•   एग्रोबैक्टीरियम एक ग्राम-ऋणात्मक जीवाणु है जो पौधों की जड़ों के आसपास की मिट्टी में पाया जाता है।

•   एग्रोबैक्टीरियम बैक्टीरिया की दो प्रजातियाँ द्विबीजपत्री पौधों में रोग उत्पन्न करती हैं:-

i. एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियंस 

ii. एग्रोबैक्टीरियम राइजोजेन्स 

i.  एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियंस :-  यह एंजियोस्पर्म पौधों में क्राउन गॉल रोग का कारण बनता है। इसमें टीआई-प्लास्मिड पाया जाता है।

ii.  एग्रोबैक्टीरियम राइजोजेन्स :-  यह एंजियोस्पर्म पौधों में रोएंदार जड़ रोग का कारण बनता है। इसमें Ri-प्लाज्मिड पाया जाता है।

•   वांछित जीन को Ti प्लास्मिड के T-DNA भाग में शामिल करके पुनर्संयोजित DNA बनाया जाता है। इन्हें एग्रोबैक्टीरियम कोशिका में स्थानांतरित किया जाता है।

•   अब रोगाणुरहित पत्तों के गोल टुकड़े काट लें।

•   अब इन टुकड़ों को एग्रोबैक्टीरियम के साथ रात भर इनक्यूबेट करें।

•   अब इन टुकड़ों को दो दिनों के लिए शूटिंग मीडियम में रखा गया।

•   अब इस शूटिंग मीडियम में कैनामाइसिन और कार्बेनिकिलिन मिलाएं और 3-4 सप्ताह तक कल्चर करें।

•   अब इसे रूटिंग मीडियम में स्थानांतरित करें, इसमें कैनामाइसिन और कार्बेनिसिलिन मिलाएं और इसे 3-4 सप्ताह तक कल्चर करें।

•   अब इस पौधे को ग्रीनहाउस में एक गमले में लगा दें।

•   कुछ दिनों बाद, पौधे को खेत की मिट्टी में लगा दें।

जीन स्थानांतरण की प्रक्रिया:-

•   टीआई-प्लास्मिड के टी-डीएनए भाग में यह गुण होता है कि यह पौधे के जीनोम में एकीकृत हो सकता है।

•   पत्ती के टुकड़े एसिटो-सिरिंगिन नामक रसायन छोड़ते हैं जो टी-डीएनए के विर-ऑपेरॉन को सक्रिय करता है।

•   सक्रिय होने के बाद, टी-डीएनए भाग प्लास्मिड से अलग हो जाता है और कई पादप कोशिकाओं में प्रवेश कर जाता है।

•   अब यह टी-डीएनए केंद्रक में जाकर जीनोम में एकीकृत हो जाता है।

•   इसके परिणामस्वरूप पौधे का स्थिर रूपांतरण होता है।